排斥性導向分子B(Repulsive guidance molecules B, RGMB)在肺癌的發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機制.pdf

1、研究背景：
　　在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌中已有研究表明排斥導向分子B（Repulsive guidance molecules B，RGMB）表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展相關；在我們前期研究中發(fā)現(xiàn)肺癌組織內(nèi)RGMB表達相比于正常組織低，也發(fā)現(xiàn)RGMB低表達與腫瘤患者差預后相關，而RGMB分子對肺癌細胞功能影響仍未知。此外RGMB作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)（Bone Morphogenetic Proteins,BMPs）的共表達受體，是

2、否會參與調(diào)控BMPs信號通路仍未知。為此，我們將探索RGMB分子對肺癌細胞功能的影響，以及RGMB分子調(diào)控肺癌發(fā)生發(fā)展的具體機制。
　　研究方法：
　　采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）法檢測人肺癌細胞株RGMB mRNA表達水平；構(gòu)建pLVX-mCMV-ZsGreen-puro-RGMB過表達載體和pLVX-ShRNA

3、-Puro-RGMB敲低載體；用RGMB過表達和敲低載體轉(zhuǎn)染293T細胞包裝得到慢病毒顆粒；用病毒顆粒感染肺癌細胞從而得到RGMB穩(wěn)定過表達及穩(wěn)定敲低細胞株。通過細胞侵襲、黏附及轉(zhuǎn)移能力來研究RGMB對細胞功能的影響。Western blot檢測RGMB表達改變后BMPs信號通路中蛋白分子的表達及活化的改變。
　　研究結(jié)果：
　　在本實驗中，首先我們采用rt-PCR法在mRNA水平檢測H520、Calu3、HCC827、PC

4、-9、H1650、Am1010、SPC-A-1、A0907、H1395、H1299、A549、H460肺癌細胞中RGMB mRNA的表達情況，成功選出常用且RGMB表達相對高的人肺癌細胞株A549用于進一步實驗。
　　為了得到RGMB穩(wěn)定過表達和穩(wěn)定敲低的A549細胞株，首先根據(jù)RGMB基因mRNA序列全長設計引物，通過PCR擴增后瓊脂糖凝膠電泳得到RGMB mRNA全長DNA，根據(jù)RGMB-ShRNA序列設計正義鏈和反義鏈，退火

5、后得到shRNA DNA序列；將PCR得到的RGMB DNA序列和退火得到的shRNA DNA序列分別與pLVX-mCMV-ZsGreen-puro和pLVX-ShRNA-Puro質(zhì)粒重組，從而成功構(gòu)建RGMB過表達和敲低的載體并通過PCR和基因測序驗證；過表達載體和敲低載體通過轉(zhuǎn)染293T細胞包裝得到慢病毒顆粒；通過慢病毒顆粒感染A549細胞經(jīng)篩選最終得到RGMB穩(wěn)定過表達和敲低的A549細胞。
　　為了研究RGMB基因?qū)54

6、9細胞功能的影響，我們選擇RGMB過表達株、敲低株和對照株對比其侵襲、浸潤和遷移能力，結(jié)果顯示RGMB分子能抑制肺癌細胞的黏附、侵襲和轉(zhuǎn)移。
　　進一步探索RGMB是否參與BMP信號通路來影響肺癌的功能，我們選擇RGMB敲低A549細胞與對照組A549細胞株，用Western blot檢測BMP信號通路中蛋白分子，發(fā)現(xiàn)RGMB敲低組Smad-1/5/8磷酸化水平上升，差異具有統(tǒng)計學意義；而ERK和JNK活化水平兩組相比未有明顯改變