B型排斥性導向分子在肺癌中的表達與預后研究.pdf

1、腫瘤的轉(zhuǎn)移和復發(fā)是其惡性表現(xiàn)最基本的特征，同時這也是影響患者預后最主要的因素。近年來，肺癌的發(fā)病率逐年提高，現(xiàn)已經(jīng)成為最為高發(fā)的腫瘤之一，其也位居腫瘤相關(guān)性致死率方面的首位。目前，對于早期的肺癌患者來說，根治性手術(shù)切除仍然是首選的治療方式。盡早發(fā)現(xiàn)盡早治療，可以明顯提高患者的預后水平和生活質(zhì)量。然而，大多數(shù)患者在診斷疾病時已處于中晚期，治療方式主要以放化療手段為主。即便有些患者術(shù)后診斷為早期肺癌，但部分仍有可能出現(xiàn)復發(fā)和轉(zhuǎn)移。當前，由于

2、肺癌早期階段的發(fā)生發(fā)展較為隱匿，同時缺乏特異性的篩查指標和預防措施，有些患者即便接受手術(shù)或者放化療，其預后仍然不理想。因此，了解肺癌的發(fā)生發(fā)展機制并進一步探索其生物學特性從而顯得至關(guān)重要。
　　B型排斥性導向分子(Repulsive guidance molecules B，RGMB)是排斥性導向分子(RGMs)家族的成員之一。先前已有研究表明在乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌中，RGMB的表達異常與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的相關(guān)性。但在

3、肺癌中仍少見相關(guān)報道。另外，RGMB作為骨形態(tài)發(fā)生蛋白質(zhì)(Bone Morphogenetic Proteins，BMPs)的共表達受體，其是否會參與并調(diào)控BMPs信號通路仍然未知。前期有研究顯示，RGMs可改變腫瘤細胞的惡性生物學行為，抑制其侵襲轉(zhuǎn)移的能力。本研究的目的旨在研究RGMB在肺癌中的表達情況和其相關(guān)的生物學行為。
　　目的：
　　本課題首先通過搜索TCGA(The Cancer Genome Atlas)數(shù)據(jù)庫

4、搜集肺癌組織中RGMB的表達情況，利用統(tǒng)計學方法分析表達的相關(guān)性。進一步通過RT-PCR(real-time polymerase chain reaction)檢測了本院120例肺癌組織和30例正常肺組織中RGMB基因的表達情況，分析RGMB基因表達水平與患者臨床指標及疾病預后的相關(guān)性。同時，檢測對不同肺癌細胞株進行RGMB基因表達水平的檢測，篩選出高表達的細胞株并構(gòu)建穩(wěn)定的RGMB基因敲除細胞模型，為下一步驗證其對腫瘤細胞功能的影響

5、和通路研究做進一步準備。
　　方法：
　　1.對TCGA數(shù)據(jù)庫進行分析，研究RGMB表達情況與肺癌的相關(guān)性。
　　2.對臨床正常肺組織和肺癌組織標本中RGMB基因的表達量應用熒光定量PCR方法檢測，前瞻性分析RGMB表達水平與臨床病理、分期及預后的關(guān)系。
　　3.對高表達RGMB基因的肺癌細胞株進行篩選，使用熒光定量PCR對多種肺癌細胞株進行RGMB mRNA的檢測，從而進一步篩選出RGMB基因處于高表達的肺癌細

6、胞株，為后續(xù)的實驗作進一步準備。
　　4.pLVX-shRNA-Puro-RGMB真核表達載體的構(gòu)建及其鑒定利用國際上公認的引物設(shè)計網(wǎng)站設(shè)計及篩選相關(guān)序列，交由生物公司進行合成。將所設(shè)計的引物與pLVX-Puro質(zhì)粒重組之后，同時制備感受態(tài)的大腸桿菌，對其進行轉(zhuǎn)染，對其結(jié)果進行陽性克隆的鑒定，并提取質(zhì)粒;再利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染293T細胞株，對其轉(zhuǎn)染干擾效率應用熒光定量PCR檢測進行檢測，將高干擾效率片段篩選出后并進行慢病毒包裝和后續(xù)實

7、驗。
　　5.慢病毒LV-RGMB-scramble和LV-RGMB-shRNA的制備，感染A549細胞株
　　在293T細胞中進行慢病毒的包裝、收集及滴度測定，進一步使用該病毒感染篩選出的高表達RGMB的肺癌細胞株A549，利用嘌呤霉素進行穩(wěn)定篩選和培養(yǎng)，從而獲得RGMB基因穩(wěn)定敲除的肺癌細胞株，轉(zhuǎn)染效率利用mRNA的測定進行判定，分別從蛋白及基因及水平利用western blot法和熒光定量PCR對轉(zhuǎn)染細胞株中RGMB的

8、表達情況進行檢測。
　　6.沉默RGMB基因?qū)Ψ伟〢549細胞功能的影響
　　利用MTT實驗(methyl thiazolyl tetrazolium test)根據(jù)細胞存活率來描述細胞的生長情況;利用細胞粘附實驗觀察其黏附能力;對細胞的遷移及侵襲能力的測定則利用劃痕實驗、細胞遷移實驗及Transwell侵襲實驗進行觀察。
　　7、利用Western blot對RGMB表達降低的細胞株中BMPs信號通路蛋白分子表達的檢

9、測。
　　結(jié)果：
　　1.通過TCGA數(shù)據(jù)庫中肺癌RGMB表達情況的分析得出，RGMB基因在腫瘤組織中下調(diào)，并且與T和N分期具有顯著的負相關(guān)性。在男性患者中表達較低。
　　2.進一步對本院肺癌標本進行研究，對RGMB的基因表達水平應用RT-PCR進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常肺組織相比，肺癌組織中RGMB基因表達水平顯著降低(P＜0.05）。同時，發(fā)現(xiàn)女性患者含有的RGMB表達水平相對較高。肺癌晚期人群RGMB表達水平較低

10、，而早期人群RGMB水平高表達(P＜0.05)。結(jié)果提示RGMB高表達與較好的臨床預后和生存狀態(tài)相關(guān)。
　　3.成功篩選出了肺癌細胞株A549為高表達RGMB基因的細胞株。并成功構(gòu)建針對RGMB基因的RNAi真核質(zhì)粒，經(jīng)酶切鑒定，將所得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細胞后，RT-PCR結(jié)果提示該質(zhì)?？梢援a(chǎn)生理想的干擾效果。
　　4、成功包裝了慢病毒LV-RGMB-scramble、LV-RGMB-shRNA，進一步將其感染A549肺癌細

11、胞株，經(jīng)嘌呤霉素進行篩選后，結(jié)果提示實驗組A549細胞RGMB的mRNA的表達比未處理細胞下降約65％(p＜0.05)。表明已成功構(gòu)建RGMB基因穩(wěn)定敲除的肺癌細胞株。
　　5、A549RGMB基因穩(wěn)定沉默肺癌細胞株體外增殖能力、黏附、遷移和侵襲能力與對照組相比明顯增強(P＜0.05)。
　　6、為了研究RGMB是否參與BMP的信號通路，利用RGMB穩(wěn)定沉默和對照組A549細胞株進行研究。用Western blot檢測BMP

12、s信號通路中蛋白分子，發(fā)現(xiàn)RGMB沉默后Smad-1/5/8磷酸化水平上升(p＜0.05);然而ERK和JNK蛋白的活化水平兩組間未見明顯改變。該結(jié)果認為RGMB可能是通過抑制Smad1/5/8通路來發(fā)揮抑制腫瘤的作用。
　　結(jié)論：
　　1、成功構(gòu)建了針對RGMB基因的慢病毒干擾載體，對肺癌細胞A549中RGMB基因的表達狀態(tài)可持續(xù)穩(wěn)定的發(fā)揮抑制作用。
　　2、沉默RGMB基因的表達能夠促進肺癌細胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移等