DRC3f及eRF3b在肝病發(fā)生發(fā)展中作用機制的初步研究.pdf

1、全世界大概有3.6億人口感染了乙型肝炎病毒，而長期慢性感染容易發(fā)生肝硬化，肝失代償甚至誘發(fā)肝癌。盡管由于全球嬰兒乙肝疫苗免疫計劃的推行使得慢性肝炎發(fā)病率有所下降，但由于乙型肝炎病毒導致的肝癌的發(fā)病率至少在未來的20多年仍會上升。
　　 本室前期本著尋找早期生物標志物用于臨床診斷的目的，應用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of f

2、light mass spectrometry，MALDI-TOF MS）檢測到兩個小分子多肽，其中一個16個氨基酸的小肽經(jīng)二級質(zhì)譜鑒定為脫精氨酸補體C3f(DRC3f)，乙型肝炎的輕度及中度病人血清中表達量高于重度病人血清。補體系統(tǒng)是人體免疫很重要的組成部分，補體在外周血中以非活性形式存在，除了具有非特異性防御及參與機體的一系列特異性免疫應答外，在一些非免疫性因素的刺激下，補體亦可被活化產(chǎn)生炎癥反應，并引起組織細胞損傷。補體中C3的含

3、量最高，在補體激活過程中，C3活化形成的C3b進一步通過CR1或H因子幫助下由Ⅰ因子分解為滅活的iC3b和17肽C3f。后者在羧基肽酶-N作用下脫精氨酸，迅速生成16肽DRC3f。許多研究表明，補體C3包括C3f及其一些片段在疾病進展中充當了重要角色。
　　 檢測到的另一個37個氨基酸的多肽經(jīng)鑒定屬于真核肽鏈釋放因子eRF3b，慢性肝炎患者血清中該多肽含量較高，肝癌及肝硬化病人血清中含量較低。真核生物中終止蛋白合成需要兩類多肽釋

4、放因子，eRF1和eRF3。eRF1識別終止密碼子，激發(fā)肽?；鵷RNA鏈的水解，eRF3具有GTP酶活性，以GTP依賴的形式刺激eRF1釋放因子的活性。哺乳動物中eRF3有兩種，即eRF3a和eRF3b，各有637及628個氨基酸，分別由GSPT1和GSPT2編碼，二者有87％的同源性。真核肽鏈釋放因子eRF3除了在翻譯終止過程中以GTP依賴的形式調(diào)節(jié)蛋白的合成外，還參與了調(diào)節(jié)細胞周期的轉(zhuǎn)相，參與腫瘤的形成等，盡管機制不是很清楚。研究顯

5、示eRF3a是哺乳動物翻譯終止過程中的主要因子，它的表達水平?jīng)Q定著終止復合物的形成，而且目前大多數(shù)研究都是針對eRF3a所進行的，但是在哺乳動物中，eRF3b可以實現(xiàn)eRF3a在翻譯終止時的所有功能。第一部分脫精氨酸補體C3f(DRC3f)對體外肝細胞增殖的促進作用
　　 目的：作為補體激活的標志，補體C3f以及DRC3f可以作為肝臟損傷的一種生物標志物，可以為臨床診斷提供參考，但其參與乙肝的病理變化的機制尚不清楚，因此本研究將

6、對該多肽的作用機制做初步研究。
　　 方法：用含有DRC3f的血清以及固相合成的DRC3f刺激正常肝細胞QSG-7701，MTT法檢測對肝細胞增殖的影響，并且提取RNA，采用實時熒光定量PCR方法分析細胞內(nèi)轉(zhuǎn)化生長因子TGFβ1以及一型膠原ColⅠ的表達情況。
　　 結(jié)果：輕、中、重度肝炎患者以及正常人的血清對QSG-7701細胞作用之后發(fā)現(xiàn)，輕度和中度肝炎血清對細胞刺激后的增殖較重度肝炎及正常血清快，F(xiàn)值為55.715

7、，P＜0.01。將血清用3Kd的超濾管超濾之后作用于細胞，可以觀察到同樣的效果，F(xiàn)值為26.325，P＜0.01。為了進一步確認，本研究應用合成的DRC3f刺激QSG-7701細胞，同時以星狀細胞LX-02作為對照，結(jié)果發(fā)現(xiàn)合成的DRC3f對肝細胞增殖有促進作用，對星狀細胞影響不大。實時熒光定量測定結(jié)果顯示，隨著DRC3f的劑量的增加，TGFβ1和COLⅠ的表達下降，以18S rRNA為內(nèi)參，與未刺激組比較，TGFβ1的表達為0.96（

8、62.5 ng．mL-1組）、0.42（500ng．mL-1組）；COLⅠ的表達為0.93（62.5ng．mL-1組）、0.57（500ng．mL-1組）。
　　 結(jié)論：DRC3f對肝細胞增殖有促進作用，并且隨著劑量的增加，細胞因子TGFβ1和COLⅠ的表達下降。
　　 第二部分真核肽鏈釋放因子eRF3b在人肝組織及體外肝細胞中的表達
　　 目的：在腫瘤形成過程中，腫瘤細胞的變化如蛋白合成率的增加、參與細胞周期增

9、殖的某些特異蛋白的過表達往往和翻譯因子的變化有關，一系列的證據(jù)支持真核翻譯因子如翻譯起始因子、延伸因子在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的角色，但是關于釋放因子的研究甚少，所以本研究將探討真核肽鏈釋放因子eRF3b在肝組織及不同細胞株的表達情況，為下一步機制研究奠定基礎。
　　 方法：利用免疫組化法分析eRF3b在肝癌組織及癌旁組織中的表達情況，實時定量PCR中以18s rRNA為內(nèi)參照，用2-△△Ct法對GSPT2、ERF1以及GSPT1在正常

10、肝細胞QSG-7701、肝癌細胞HepG2、HBV整合的肝癌細胞HepG2.215中的mRNA水平進行分析，RIPA裂解細胞提取蛋白，以α-tublin為內(nèi)參照，Western Blot檢測eRF3b蛋白的表達水平。
　　 結(jié)果：4對肝組織標本（癌和癌旁組織）的免疫組化結(jié)果顯示，eRF3b在實質(zhì)細胞及間質(zhì)細胞均有陽性表達，不同細胞株細胞爬片的免疫組化結(jié)果顯示eRF3b在胞質(zhì)表達；實時熒光定量PCR結(jié)果顯示GSPT2在各細胞株的表

11、達有所差異，在HepG2細胞中表達量高于QSG-7701以及HepG2.215細胞，而ERF1以及GSPT1在HepG2.215中表達量明顯高于其他兩種細胞株。Western Blot檢測中，以α-tublin為內(nèi)參照，肝癌細胞珠HepG2的相對表達量0.73，其它兩個細胞株分別為0.25及0.24，eRF3b在HepG2中表達量高于其它兩個細胞株，而QSG-7701與HepG2.215細胞中eRF3b表達量沒有差異。
　　 結(jié)

12、論：eRF3b在肝組織及培養(yǎng)的細胞株中陽性表達，以HepG2細胞株的表達較高。
　　 第三部分外源性eRF3b對HepG2細胞增殖及細胞周期的影響
　　 目的：通過上調(diào)或下調(diào)eRF3b在HepG2細胞中的表達進而對eRF3b在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用進行初步研究。
　　 方法：構建綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111，瞬時轉(zhuǎn)染至HepG2細胞，熒光顯微鏡觀察蛋白的定

13、位，同時構建短發(fā)卡干擾RNA的表達載體pSilencer2.1-GSPT2及pSilencer2.1-GSPT1，瞬時轉(zhuǎn)染至HepG2細胞，pSilencer2.1-GSPT2轉(zhuǎn)染組記為eRF3b(-)，pSilencer2.1-GSPT1轉(zhuǎn)染組記為eRF3a（-）。轉(zhuǎn)染不同重組質(zhì)粒后應用Western Blot法觀察目的蛋白表達量的變化，MTT比色法檢測轉(zhuǎn)染前后細胞活力變化，平板克隆形成試驗分析eRF3b對單細胞克隆增殖的影響，流式細

14、胞儀測定細胞周期的變化。
　　 結(jié)果：成功構建綠色熒光蛋白表達質(zhì)粒pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111，瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞后，熒光顯微鏡下觀察蛋白定位于胞質(zhì)；細脆固定后，流式檢測轉(zhuǎn)染效率為65.1％，pEGFP-C2-GSPT2以及pEGFP-C2-GSPT2-111的轉(zhuǎn)染對細胞周期沒有影響。shRNA表達質(zhì)粒pSilencer2.1-GSPT2及pSilencer2.1-GSPT1進行測序證

15、實構建成功，瞬時轉(zhuǎn)染HepG2細胞，0h、24h及54h分別收集細胞提取蛋白，Western blot測定，發(fā)現(xiàn)干擾54h能夠沉默58％左右的蛋白表達；MTT測定結(jié)果顯示，eRF3b干擾組吸光度均值為0.1893(N=18)，eRF3a干擾組吸光度均值為0.147(N=18)，pSilencer對照組吸光度均值為0.259(N=18)，eRF3b干擾組及eRF3a干擾組細胞活力都較對照組下降，與eRF3b干擾組比較，eRF3a干擾組細胞

16、活力較低；平板克隆形成實驗結(jié)果表明eRF3b的缺失導致了細胞增殖能力的下降。流式細胞儀進行細胞周期分析，發(fā)現(xiàn)eRF3b的缺失導致了細胞周期的改變：與pSilencer對照組比較，eRF3b（-）組G1期細胞百分比由28.9％上升至65％，S期細胞百分比由41％減少至20.1％。
　　 結(jié)論：干擾GSPT2mRNA表達后細胞周期改變，G1期細胞百分比增多，而且eRF3b的缺失導致了細胞的活力以及增殖能力下降，上述結(jié)果為了解eRF3