腫瘤壞死因子-alpha中和對(duì)LPS致ALI小鼠肺組織保護(hù)性作用研究.pdf

1、研究背景和目的:
　　 各種性質(zhì)的肺刺激因素,如細(xì)菌感染、物理創(chuàng)傷、化學(xué)損傷等,均可通過活化炎癥反應(yīng)而引起肺組織損傷,當(dāng)肺組織嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)可發(fā)生急性呼吸窘迫綜合征(Acute Respiratory Distress Syndrome,ARDS)。目前認(rèn)為急性肺損傷(AcuteLung Injury,ALI)是ARDS的早期階段。在ARDS的早期階段——ALI進(jìn)行治療,中斷ALI進(jìn)程,將提高ARDS治療的成功率。
　　 A

2、LI的發(fā)生、發(fā)展過程是炎癥失控地放大的過程。因此,ALI的治療不僅需要有效的抗感染療法,而且需要對(duì)機(jī)體防御系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控,下調(diào)過度的全身炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激,減少炎癥細(xì)胞、炎癥介質(zhì)及氧自由基對(duì)肺組織結(jié)構(gòu)細(xì)胞的破壞,維持呼吸系統(tǒng)功能。在炎癥反應(yīng)或氧化應(yīng)激活化的過程中,腫瘤壞死因子-α(Tumor Necrosis Factor alpha,TNF-α)起著重要作用。
　　 TNF-α的生成主要由核因子kappa B(Nuclear F

3、actor kappa B,NF-κB)調(diào)控。當(dāng)促炎因子刺激炎癥細(xì)胞后,NF-κB活化發(fā)生核易位,與κB序列結(jié)合,啟動(dòng)TNF-α的表達(dá)。致炎因素引起NF-αB首次活化與TNF-α釋放,此部分TNF-α與炎癥細(xì)胞的TNF受體(TNF Receptor,TNFR)結(jié)合,再次活化NF-κB,通過正反饋機(jī)制放大炎癥反應(yīng)。TNF-α除可以激活NF-κB信號(hào)通路,還可以激活JNK,介導(dǎo)細(xì)胞凋亡,或激活氧化應(yīng)激信號(hào)途徑,活化NADPH氧化酶、一氧化氮

4、合酶等氧化酶,促進(jìn)內(nèi)源性氧自由基生成,氧化細(xì)胞成份,破壞細(xì)胞的生理功能。上述因素的綜合性損傷引起肺組織細(xì)胞凋亡與肺結(jié)構(gòu)破壞。
　　 血清或肺泡灌洗液中TNF-α濃度與ALI嚴(yán)重程度呈正相關(guān),因此通過下調(diào)游離TNF-α濃度是控制炎癥與氧化性損傷及降低ALI危害的策略。
　　 使用藥物中和游離TNF-α是降低TNF-α濃度的有效、易行方法。到目前為止,已開發(fā)的中和TNF-α的藥物主要有兩大類,分別為TNF受體融合蛋白(TNF

5、R-Fc),即TNFR與Ig G的Fc段所形成的融合蛋白和人源化的抗TNF-α單抗,前者代表性的商品化藥物有依那西普,后者有英利昔單抗,二者均可與TNF-α結(jié)合,抑制其與受體結(jié)合而中和其生物活性。上述兩類藥物普遍用于TNF-α分泌異常引起的免疫性疾病,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎、Crohn病等。雖然上述藥物目前僅用于非感染性疾病,但作為有效下調(diào)血清TNF-α的藥物,TNF-a中和策略能否有效減輕感染誘發(fā)的肺組織損傷仍存爭(zhēng)議。

6、　　 本研究將復(fù)制LPS致ALI小鼠模型,探討TNFR-Fc對(duì)減輕ALI病理生理過程中炎癥反應(yīng)損傷、氧化損傷及肺組織細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。首先比較腹膜腔注射LPS與氣管內(nèi)滴入LPS致ALI小鼠模型的差異,選擇對(duì)研究中和TNF-α保護(hù)肺組織合適的動(dòng)物模型,并在此基礎(chǔ)上分別研究中和TNF-α對(duì)肺組織炎癥反應(yīng)強(qiáng)度、氧化損傷與組織細(xì)胞凋亡的影響,探討TNF-α中和策略用于ALI的可行性。
　　 研究方法
　　 1氣管內(nèi)滴入LP

7、S與腹膜腔注射LPS致小鼠ALI模型的特征比較
　　 小鼠隨機(jī)分為3組,氣管內(nèi)滴入LPS(LPS intratracheal administration,IT)組小鼠分離暴露氣管后從氣管內(nèi)滴入LPS溶液,腹膜腔內(nèi)注射LPS(LPSintraperitoneal administration)組小鼠腹膜腔內(nèi)注射LPS溶液,對(duì)照組小鼠不給予LPS處理。分別在第0、1、2、6、12、18、24、48小時(shí)取樣進(jìn)行檢測(cè)。小鼠進(jìn)行支氣管肺

8、泡灌洗,灌洗液離心后取上清,ELISA法檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液中蛋白含量與TNF-α濃度；腹主動(dòng)脈取血離心分離血清,ELISA法檢測(cè)血清TNF-α濃度；小鼠開胸取肺,稱量肺組織干燥前后重量并計(jì)算肺組織濕/干重比例；取肺前沖洗肺組織血管床后福爾馬林固定,石蠟包埋切片與HE染色,通過急性肺損傷評(píng)分比較IT組與IP組、對(duì)照組小鼠肺組織破壞程度。
　　 2 TNFR-Fc對(duì)ALI小鼠肺組織的保護(hù)作用
　　 選用氣管內(nèi)滴入LPS的方

9、法復(fù)制LPS致ALI小鼠模型。小鼠分為L(zhǎng)PS組、TNFR-Fc+LPS組與對(duì)照組。LPS組僅氣管內(nèi)滴入LPS溶液；TNFR-Fc+LPS組在LPS滴入前24小時(shí)腹腔注射TNFR-Fc進(jìn)行預(yù)處理；對(duì)照組小鼠氣管內(nèi)滴入與LPS溶液等體積的生理鹽水。分別在LPS或生理鹽水滴入后第0、0.5、1、2、4、6小時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。腹主動(dòng)脈取血,離心取血清,ELISA法檢測(cè)血清TNF-α濃度；小鼠進(jìn)行支氣管肺泡灌洗,灌洗液離心后取上清,BCA法檢測(cè)BALF

10、中蛋白含量；取肺組織測(cè)量濕/干重比例；肺組織沖洗血管床后福爾馬林固定,石蠟包埋切片,HE染色后肺組織病理評(píng)分檢測(cè)肺組織損傷程度,TUNEL法檢測(cè)肺組織凋亡程度。
　　 3 TNFR-Fc對(duì)炎癥反應(yīng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 氣管內(nèi)滴入LPS復(fù)制ALI小鼠模型,分組處理同上。ELISA法檢測(cè)BALF與血清中IL-1β、IL-6、IL-10、IFN-γ濃度；肺組織勻漿后抽提總RNA,real—timeRT-PCR檢測(cè)肺組織TNF

11、-α與NF-kB基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度變化；肺組織勻漿后抽提肺總蛋白,Western Blot檢測(cè)肺組織Erk、p38、JNK的磷酸化程度。
　　 4 TNFR-Fe對(duì)ALI小鼠肺組織氧化損傷的影響
　　 氣管內(nèi)滴入LPS復(fù)制ALI小鼠模型,分組處理同上。肺組織勻漿后抽提總RNA,real-time RT-PCR檢測(cè)肺組織iNOS、Nox1、Nox2、Nox4、XO、SOD等氧化酶的基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度變化；抽提肺組織總蛋白,比色法檢測(cè)肺

12、組織MDA含量與總抗氧化能力。
　　 結(jié)果
　　 1氣管內(nèi)滴入LPS與腹膜腔注射LPS致小鼠AIl模型的特征比較
　　 1.1 IT組與IP組小鼠在LPS滴入后BALF/血清TNF-α濃度與對(duì)照組相比均顯著升高(BALF:P均<0.020;血清:P均<0.001),呈先升高后下降趨勢(shì),但I(xiàn)T組與IP組比較無顯著差異(BALF:P=0.075；血清:P=0.755)。
　　 1.2 IT組與IP組小鼠在LP

13、S滴入后BALF中蛋白含量與對(duì)照組相比均顯著升高(P均<0.001),呈先升高后下降趨勢(shì),但I(xiàn)T組與IP組比較無顯著差異(P=0.545)。
　　 1.3 IT組與IP組小鼠在LPS滴入后肺濕/干重比例與對(duì)照組相比顯著升高(P均<0.001),呈先升高后下降趨勢(shì),但I(xiàn)T組與IP組比較無顯著差異(P=0.009)。
　　 1.4 IT組小鼠在LPS滴入后2h肺組織切片尚可辨認(rèn)出肺泡結(jié)構(gòu),但肺泡間隔增厚,炎細(xì)胞浸潤(rùn),6h肺泡

14、結(jié)構(gòu)已破壞,24h無法辨認(rèn)肺泡結(jié)構(gòu),肺內(nèi)大量炎細(xì)胞浸潤(rùn),以中性粒細(xì)胞為主,伴出血與水腫形成；IP組肺組織損傷較IT組輕,各時(shí)間點(diǎn)均可辨認(rèn)肺泡結(jié)構(gòu),但肺泡間隔增厚,中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),主要見于間隔及間隔內(nèi)血管,部分肺泡腔內(nèi)有少量滲出；對(duì)照組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)清晰,肺泡壁薄,肺泡內(nèi)未見水腫液。IT組小鼠急性肺損傷評(píng)分在LPS滴入后與對(duì)照組相比顯著升高(P=0.000),IP組評(píng)分也顯著高于對(duì)照組(P=0.000)；IT組評(píng)分顯著高于IP組(P均<0

15、.001)。
　　 2 TNFR-Fc對(duì)ALI小鼠肺組織的保護(hù)性作用
　　 2.1 TNFR-Fc-LPS組小鼠血清TNF-α濃度顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 2.2 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF蛋白含量在LPS滴入后與對(duì)照組相比顯著增高(P均<0.002),TNFR-Fc+LPS組BALF蛋白含量顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 2.3 LPS組與TNFR-Fc

16、+LPS組小鼠肺濕/干重比例在LPS滴入后與對(duì)照組相比顯著升高(P均<0.029),LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺濕/干重比例無顯著差異(P=0.694)。
　　 2.4 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織結(jié)構(gòu)在LPS滴入后出現(xiàn)顯著破壞。TNFR-Fc+LPS組小鼠ALI評(píng)分顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 2.5 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織細(xì)胞在LPS滴入后凋亡率顯著升高

17、,TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 3 TNFR-Fc對(duì)炎癥反應(yīng)及轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響
　　 3.1 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF與血清IL-1β濃度在LPS滴入后均有所增高。在整體水平上,TNFR-Fc+LPS組與LPS組的BALF IL-1β濃度無顯著差異(P=0.109),而TNFR-Fc+LPS組血清IL-1β濃度顯著低于LPS組(P=0.013)

18、。
　　 3.2 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF與血清IL-6濃度在LPS滴入后與對(duì)照組相比顯著增高。在整體水平上,TNFR-Fc+LPS組BALF與血清IL-6濃度均顯著低于LPS組(P均<0.001)。
　　 3.3 LPS組小鼠BALF IL-10濃度在LPS滴入后無顯著增高,TNFR-Fc+LPS組BALF IL-10濃度與對(duì)照組相比略有增高,且在整體水平上顯著高于LPS組(P=0.022)。LP

19、S組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IL-10濃度在氣管內(nèi)滴入LPS后增高。TNFR-Fc+LPS組血清IL-10濃度顯著高于LPS組(P=0.001)。
　　 3.4 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠BALF IFN-γ濃度在LPS滴入后無顯著差異(P=0.747),與對(duì)照組相比也無顯著差異。LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠血清IFN-γ濃度在LPS滴入后顯著高于對(duì)照組,而LPS組與TNFR-Fc+LPS組相比則

20、無顯著差異(P=0.058)。
　　 3.5 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織TNF-α基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在LPS滴入后與對(duì)照組相比顯著增高,呈先升高后下降趨勢(shì)。在整體水平上,TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織TNF-α基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 3.6 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織NF-κB基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在LPS滴入后與對(duì)照組相比顯著增高,且在檢測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)持續(xù)性增高。在

21、整體水平上,TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織NF-κB基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度顯著低于LPS組(P=0.003)。
　　 3.7 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織Erk1/2磷酸化水平在LPS滴入后顯著升高。在整體水平上,TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織Erk1/2磷酸化水平顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 3.8 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織p38磷酸化水平在LPS滴入后顯著升高,呈先升高

22、后下降趨勢(shì)。在整體水平上,TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織p38磷酸化水平顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 3.9 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織JNK磷酸化水平在LPS滴入后顯著升高。在整體水平上,TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織JNK磷酸化水平顯著低于LPS組(P<0.001)。
　　 4 TNFR-Fc對(duì)ALI小鼠肺組織氧化損傷的影響
　　 4.1 LPS組小鼠肺組織MDA含量顯

23、著高于對(duì)照組,呈先升高后下降趨勢(shì)。TNFR-Fc+LPS組MDA含量在整體水平上低于LPS組(P=0.002)。
　　 4.2 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織總抗氧化能力在LPS滴入后均顯著下降,但TNFR-Fc+LPS組總抗氧化能力高于LPS組(P=0.002)。
　　 4.3 LPS組與TNFR-Fc+LPS組小鼠肺組織iNOS基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在LPS滴入后2小時(shí)后與對(duì)照組相比均顯著升高,在整體水平上TNF

24、R-Fc+LPS組轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度低于LPS組(P=0.020)。
　　 4.4 LPS組與TNFR-Fc+LPS組肺組織Nox1與Nox4基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在氣管內(nèi)滴入LPS后顯著高于對(duì)照組,呈先升高后下降趨勢(shì)。TNFR-Fc+LPS組Nox1與Nox4基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在整體水平上低于LPS組(Nox1:P<0.001；Nox4:P=0.001)。
　　 4.5 LPS組與TNFR-Fc+LPS組肺組織Nox2與XO基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在氣管內(nèi)

25、滴入LPS后顯著高于對(duì)照組并在檢測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)持續(xù)性升高。TNFR-Fc+LPS組Nox2與XO基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在整體水平上低于LPS組(Nox2:P=0.006;XO:P=0.001)。
　　 4.6 LPS組與TNFR-Fc+LPS組肺組織SOD基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在氣管內(nèi)滴入LPS后顯著高于對(duì)照組并在檢測(cè)時(shí)間范圍內(nèi)持續(xù)性升高。TNFR-Fc+LPS組SOD基因轉(zhuǎn)錄強(qiáng)度在整體水平上與LPS組相比無顯著差異(P=0.130)。