屋塵螨主要過敏原蛋白Derp2在大腸桿菌中可溶性表達(dá)與純化.pdf

1、目的:本研究旨在通過分子伴侶蛋白的協(xié)助實(shí)現(xiàn)屋塵螨主要過敏原Derp2的原核可溶性表達(dá)，獲得高純度、二級(jí)結(jié)構(gòu)完整及具有與人血清IgE結(jié)合免疫活性的重組Derp2過敏原蛋白，為由屋塵螨引起的過敏性疾病的臨床診斷和免疫治療奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:以pCold-TFM質(zhì)粒（改造自pCold-TF原始質(zhì)粒）為表達(dá)載體，將合成的Derp2成熟序列（GenBank登錄號(hào)：FM177223.1）插入pCold-TFM載體的BamHI和EcoRI

2、酶切位點(diǎn)之間以獲得pCold-TFM-Derp2重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3），以IPTG在16℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。融合蛋白TF-Derp2通過鎳柱親和層析、凝膠過濾層析進(jìn)行純化后，經(jīng)HRV-3C蛋白酶酶切去除TF融合標(biāo)簽，獲得游離Derp2變應(yīng)原蛋白。高純度的Derp2以陽(yáng)離子交換層析方法獲得，通過SDS-PAGE、多角度激光光散射方法分析Derp2變應(yīng)原蛋白的純度、溶液中聚合狀態(tài)及分子量大?。徊捎脠A二色譜儀分析重

3、組 Derp2與屋塵螨培養(yǎng)基中提取的野生型Derp2(nDerp2)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的相似性，以dot-blot免疫學(xué)方法比較rDerp2和nDerp2對(duì)11例特應(yīng)性皮炎患者(11例特應(yīng)性皮炎患者均對(duì)屋塵螨提取物皮膚點(diǎn)刺試驗(yàn)呈陽(yáng)性反應(yīng))血清IgE結(jié)合活性的差異性。
　　結(jié)果:誘導(dǎo)表達(dá)后，重組TF-Derp2融合蛋白幾乎全部以可溶形式存在于菌體破碎物離心后的上清液中；純化1升大腸肝菌培養(yǎng)物可獲得5mg高純度的、可溶的rDerp2；rDer

4、p2蛋白在PBS緩沖液中以單體的形式存在，分子量大小為14.3 kDa；rDerp2與nDerp2的二級(jí)結(jié)構(gòu)基本一致，并且兩者與特應(yīng)性皮炎患者血清中IgE的結(jié)合活性基本一致。
　　結(jié)論:本方法體系通過TF融合表達(dá)可以獲得產(chǎn)量可觀、純度高、二級(jí)結(jié)構(gòu)完整并具有良好IgE結(jié)合活性的可溶性屋塵螨主要過敏原Derp2，說明TF分子伴侶融合表達(dá)體系能促進(jìn)目標(biāo)蛋白Derp2的折疊、提高其可溶性及保持其免疫活性；此研究工作為重組屋塵螨過敏原Der