雙探針法前哨淋巴結(jié)腫瘤轉(zhuǎn)移的光學(xué)成像.pdf

1、本文主要分為以下幾個(gè)部分:
　　第一部分:淋巴特異性探針（Cy5.5-HA）的構(gòu)建及對對前哨淋巴結(jié)成像
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在開發(fā)Cy5.5-HA作為淋巴特異性成像劑，并評價(jià)其用于前哨淋巴結(jié)成像效果及可能的機(jī)制，為術(shù)中前哨淋巴結(jié)活檢提供精準(zhǔn)實(shí)時(shí)的術(shù)中指導(dǎo)
　　方法:將透明質(zhì)酸(Hyaluronica acid，HA)與近紅外熒光分子Cy5.5結(jié)合，合成Cy5.5-HA作為淋巴特異性成像劑。使用酶聯(lián)免疫吸附測定(enzym

2、e-linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫熒光染色評估Cy5.5-HA對淋巴系統(tǒng)的親和性。分別將分子量5K、10K、20K HA合成的Cy5.5-HA于小鼠足底注入，每10分鐘行近紅外熒光成像至3小時(shí)，觀察其在淋巴系統(tǒng)內(nèi)的遷移和前哨淋巴結(jié)的停留時(shí)間，篩選出最佳分子量。分別將相同分子量(10K)的Cy5.5-HA和Cy5.5-PEG于小鼠足底注入后，每10分鐘行近紅外熒光成像至2小時(shí)，比較兩種探針在淋巴系

3、統(tǒng)內(nèi)的遷移和前哨淋巴結(jié)的停留時(shí)間。松節(jié)油誘導(dǎo)形成小鼠后腿局部炎癥模型第5天，分別于炎癥側(cè)和對側(cè)注入等量Cy5.5-HA，每10分鐘行近紅外熒光成像至2小時(shí)，對比兩側(cè)成像差別。
　　結(jié)果:通過ELISA和免疫熒光染色表明，Cy5.5-HA能夠結(jié)合到淋巴系統(tǒng)內(nèi)標(biāo)志物L(fēng)YVE-1。在小鼠模型中，HA最適的成像分子量是10 KDa，前哨淋巴結(jié)成像的時(shí)間窗是60分鐘到180分鐘。與對照10K Cy5.5-PEG在體內(nèi)成像相比，具有更好的前哨

4、淋巴結(jié)停留，表明Cy5.5-HA在前哨淋巴結(jié)內(nèi)的積聚，是與其特異性結(jié)合相關(guān)，而不是單純的與分子量大小相關(guān)。
　　結(jié)論: Cy5.5-HA是一種有效的淋巴顯像劑，能夠在淋巴系統(tǒng)內(nèi)特異性結(jié)合，積聚于前哨淋巴結(jié)。10K Cy5.5-HA在小鼠體內(nèi)表現(xiàn)適宜的成像時(shí)間。
　　第二部分:腫瘤特異性探針（IRDye800-mAb）構(gòu)建及對腫瘤組織成像
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在構(gòu)建腫瘤抗體探針，評估探針成像腫瘤的敏感性，以用于術(shù)中鑒別淋巴

5、結(jié)轉(zhuǎn)移，部分的替代術(shù)中淋巴結(jié)病理檢查。
　　方法:將近紅外染料IRDye800與與抗表皮生長因子受體(Epidermal growth factorreceptor，EGFR)抗體西妥昔單抗(Cetuximab)和抗人類表皮生長因子受體2(humanepidermal growth factor receptor2，HER2)抗體曲妥單抗(trastuzumab)結(jié)合，合成IRDye800-Cetuximab和IRDye800-T

6、rastuzumab兩種探針。在BALB/c裸鼠裸鼠肩部建立UM-SCC-22B皮下瘤模型后，靜脈注射IRDye800-Cetuximab(1 nmol)后0、1、4、8、16、24、48、96行近紅外熒光成像，觀察腫瘤可成像最佳時(shí)間。將UM-SCC-22B細(xì)胞使用IRDye800-Cetuximab（5 umol/L，24小時(shí)）孵育后，分不同數(shù)量(1K，3K和10K)注入到BALB/c裸鼠皮下，立即行近紅外熒光觀察，確定最小可識別細(xì)胞

7、數(shù)。將不同數(shù)量（1K，3K和10K）UM-SCC-22B，注射到BALB/c裸鼠皮下，24小時(shí)后靜脈注射IRDye800-Cetuximab(1 nmol)，24小時(shí)后行近紅外熒光成像，觀察可成像最小細(xì)胞數(shù)。
　　結(jié)果:我們構(gòu)建了腫瘤抗體近紅外探針(IRDye800-Cetuximab和IRDye800-Trastuzumab)。靜脈注射IRdye800-Cetuximab成像皮下瘤模型，在靜脈注入探針后4小時(shí)即可顯現(xiàn)腫瘤組織，并

8、在24小時(shí)到96小時(shí)維持在較高的平臺期。為驗(yàn)證抗體探針的敏感性，我們通過皮下瘤模型成像，測定出IRdye800-Cetuximab檢測UM-SCC-22B細(xì)胞的敏感性在1000個(gè)細(xì)胞級別，直徑為微米級大小，敏感性較高。
　　結(jié)論:我們可以認(rèn)定腫瘤標(biāo)志抗體探針具有較高的敏感性和較長的成像時(shí)間，因此具有用于術(shù)中成像轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的潛力。
　　第三部分:雙探針共同應(yīng)用對于前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移成像
　　目的:本實(shí)驗(yàn)旨在結(jié)合淋巴顯像劑和腫

9、瘤靶向劑，構(gòu)建一種術(shù)中定位前哨淋巴結(jié)并能同時(shí)區(qū)分前哨淋巴結(jié)內(nèi)是否有腫瘤轉(zhuǎn)移的成像方法，以提供精準(zhǔn)實(shí)時(shí)的術(shù)中指導(dǎo)。
　　方法:將Cy5.5-HA和IRDye800-Cetuximab溶液同時(shí)置于近紅外熒光成像，區(qū)分兩種光譜。將帶有Fluc+熒光素酶基因的UM-SCC-22B細(xì)胞和SKOV-3細(xì)胞，經(jīng)小鼠足底注射，分別建立頭頸癌和卵巢癌前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型，每周行生物活體發(fā)光成像觀察腫瘤生長和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。頭頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型建立后6

10、周后，靜脈注射IRDye800-Cetuximab(0.5 nmol，100 uL)探針，腫瘤原位注射Cy5.5-HA(0.2 nmol，10 uL)，對腘窩淋巴結(jié)成像，并行病理切片驗(yàn)證。卵巢癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型建立后7周后，靜脈注射IRDye800-Trastuzumab(0.5 nmol，100 uL)探針，腫瘤原位注射Cy5.5-HA(0.2 nmol，10 uL)，對腘窩淋巴結(jié)成像，并行病理切片驗(yàn)證。
　　結(jié)果:近紅外成像設(shè)備

11、良好的區(qū)分了Cy5.5-HA和IRDye800-Cetuximab兩種溶液光譜。經(jīng)過一系列應(yīng)用IRDye800標(biāo)記的抗體和Cy5.5標(biāo)記的HA對腫瘤轉(zhuǎn)移模型小鼠成像，成功的區(qū)分出未轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)、部分轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)和腫瘤組織完全占據(jù)的淋巴結(jié)等三種轉(zhuǎn)移狀態(tài)的前哨淋巴結(jié)，并得到病理結(jié)果證實(shí)。
　　結(jié)論:綜合應(yīng)用腫瘤靶向劑和淋巴顯像劑兩種探針成功地成像了前哨淋巴結(jié)，雙探針熒光成像不僅定位了前哨淋巴結(jié)，也評估了前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況。這種成像策具有提