足三里穴位局部針刺、艾灸差異響應(yīng)分子特征.pdf

1、目的：
　　采用全基因表達芯片結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)，分別構(gòu)建“足三里”穴位局部對針刺和艾灸兩種不同刺激方法響應(yīng)的差異基因表達譜和分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，挖掘“足三里”穴位局部對不同刺激的分子響應(yīng)共性和差異性特征及關(guān)鍵調(diào)控靶點，從穴位局部分子響應(yīng)切入，揭示針刺、艾灸后穴位局部響應(yīng)的分子事件及其特征，為回答穴位局部在針刺、艾灸刺激后分子水平作用原理提供實驗依據(jù)，并為進一步篩選針刺與艾灸作用的分子靶點奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　24只S

2、D大鼠隨機分為空白組、模型組、模型+針刺組（簡稱模針組）、模型+艾灸組（簡稱模灸組），注射弗氏完全佐劑（0.1ml）誘導(dǎo)佐劑性關(guān)節(jié)炎模型。模針組“足三里”穴位處予針刺15分鐘，模灸組施以溫和灸15分鐘后，立即取各組大鼠“足三里”穴位局部組織，采用Trizol法提取出樣品組織總RNA，對樣品和共同參照樣品用改良的cRNA反轉(zhuǎn)錄線性擴增法進行熒光標(biāo)記，27K大鼠全基因表達譜芯片進行雜交掃描，檢測出“足三里”穴位局部全基因表達譜，采用SAM軟

3、件，以Foldchange≥2或≤0.5，且∣Score(d)∣≥2為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異表達基因，分別構(gòu)建“足三里”穴位局部對針刺、艾灸響應(yīng)的差異基因表達譜，運用GO和KEGG數(shù)據(jù)庫對各組差異基因進行生物過程、分子功能和信號通路的富集度分析。采用STEM軟件對差異基因進STC趨勢分析，挖掘“足三里”穴位局部對針刺、艾灸響應(yīng)的共同表達、特異表達差異基因，運用boolean函數(shù)算法對進行Dynamic-GeneNet基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，并運用Cyt

4、oscape和String軟件對共同表達、特異表達差異基因及其所編碼的蛋白進行蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建。
　　結(jié)果：
　　1.差異表達基因篩選結(jié)果
　　①模型組（模型組 VS空白組），“足三里”穴位局部的差異表達基因411個，其中上調(diào)287個，下調(diào)124個。②針刺后（模針組VS模型組），“足三里”穴位局部的差異表達基因693個，其中上調(diào)313個，下調(diào)380個。③模灸組（模灸組VS模型組），“足三里”穴位局部的差異表達基因

5、498個，其中上調(diào)255個，下調(diào)243個。④針刺、艾灸后，“足三里”穴位局部響應(yīng)的共表達差異基因30個，42個針刺刺激特異響應(yīng)基因，82個艾灸刺激特異響應(yīng)基因。
　　2.差異表達基因GO富集度分析結(jié)果：
　　對針刺響應(yīng)的上調(diào)的差異表達基因顯著富集的生物學(xué)過程有39個(p＜0.001)，主要富集于細胞凋亡正調(diào)節(jié)、程序性細胞死亡正調(diào)節(jié)、有機循環(huán)物質(zhì)應(yīng)答、細胞死亡正調(diào)節(jié)、細胞循環(huán)過程等；顯著富集的分子功能有14個(p＜0.001)

6、，主要富集于Rho GTP酶催化劑活性、相同蛋白結(jié)合、脫氨酶活性、蛋白二聚作用活性、核染質(zhì)結(jié)合等。下調(diào)的差異表達基因顯著富集的生物學(xué)過程有34個(p＜0.001)，主要富集于翻譯延伸、炎癥應(yīng)答、細胞自動調(diào)節(jié)、防御反應(yīng)、細胞死亡等；顯著富集的分子功能有17個(p＜0.001)，主要富集于翻譯延伸因子活性、酶抑制劑活性、肽酶抑制劑活性、模式結(jié)合、多糖結(jié)合等。
　　對艾灸響應(yīng)的上調(diào)的差異表達基因顯著富集的生物學(xué)過程有26個(p＜0.00

7、1)，主要富集于細胞周期、無機物質(zhì)應(yīng)答、有機物質(zhì)應(yīng)答、細胞循環(huán)過程、藥物應(yīng)答等；顯著富集的分子功能有14個(p＜0.001)，主要富集于金屬離子結(jié)合，陽離子結(jié)合、離子結(jié)合、鈣離子結(jié)合、蛋白質(zhì)結(jié)合域結(jié)合等。下調(diào)的差異表達基因顯著富集的生物學(xué)過程有36個(p＜0.001)，主要富集于免疫應(yīng)答、防御應(yīng)答、損傷應(yīng)答、炎癥應(yīng)答、免疫系統(tǒng)過程正調(diào)節(jié)等；顯著富集的分子功能有19個(p＜0.001)，主要富集于酶結(jié)合、細胞因子活性、多糖結(jié)合、模式結(jié)合、

8、糖類結(jié)合等。
　　3.差異表達基因的信號通路（Pathway）富集度分析結(jié)果
　　對針刺響應(yīng)的差異表達基因富集于24個pathway（p＜0.05），按Pvalue排序靠前的有：自然殺傷細胞介導(dǎo)的細胞毒性、腎素血管緊張素系統(tǒng)、肌動蛋白細胞調(diào)節(jié)骨架、P53信號通路、血管平滑肌收縮等。
　　對艾灸響應(yīng)的差異表達基因富集于34個pathway（p＜0.05），按Pvalue排序靠前的有：補體及凝血級聯(lián)反應(yīng)、自然殺傷細胞介導(dǎo)的

9、細胞毒性、細胞粘附分子、抗原加工與遞呈、T細胞受體信號通路等。
　　4.Dynamic-GeneNet基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果：
　　共表達差異基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Pla2g2a、Prg4、Aph1b、Mgl1、Serpinb1a等是關(guān)鍵節(jié)點；對針刺特異響應(yīng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Jph2、Agt、Casq2、Rhoj、Trf等是關(guān)鍵節(jié)點；對艾灸特異響應(yīng)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，Tnnt2、Lsp1、C1r、Clec4a1、Apobec1等是關(guān)鍵節(jié)點

10、。
　　5.蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果：
　　共表達差異基因所編碼蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點是Ptgs2、Il4、Mmp3、Il13；42個針刺特異響應(yīng)的基因所編碼的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點是Serpina1、Ren、Igfbp2、Igfbp3、Plg、Ace；艾灸特異響應(yīng)的基因所編碼的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)的關(guān)鍵節(jié)點是 Serpine1、Timp1、Aurkb、C1r、C1s、Ccl7、Col1a1、Laptm5、Mmp10、N

11、edd4、Nfkbia。
　　結(jié)論：
　　1.“足三里”穴位局部對針刺、艾灸響應(yīng)的分子共性特征為：多基因、多生物過程、多分子功能、多信號通路參與；多富集于免疫和代謝相關(guān)的信號通路。
　　2.“足三里”穴位局部對針刺、艾灸的響應(yīng)的分子差異特征為：差異表達基因大部分不同；對艾灸響應(yīng)的差異表達基因富集的信號通路顯著與免疫相關(guān)。
　　3.Jph2、Agt、Casq2、Rhoj、Trf等基因可能是穴位局部對針刺響應(yīng)的特異性

12、關(guān)鍵調(diào)控基因；Tnnt2、Lsp1、C1r、Clec4a1、Apobec1等基因可能是穴位局部對艾灸響應(yīng)的特異性關(guān)鍵調(diào)控基因；Pla2g2a、Prg4、Aph1b、Mgl1、Serpinb1a等基因可能是穴位局部對針刺和艾灸響應(yīng)的共同關(guān)鍵調(diào)控基因。
　　4.Serpina1、Ren、Igfbp2、Igfbp3、Plg、Ace可能是穴位局部對針刺響應(yīng)的特異性關(guān)鍵調(diào)控蛋白；Serpine1、Timp1、Aurkb、C1r、C1s、Cc