釀酒酵母Bdf1p轉(zhuǎn)錄因子在高鹽脅迫反應(yīng)中調(diào)控機(jī)制的研究.pdf

1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是最簡單和最早完成全基因組測序的真核生物(http：//genome-www.stanford.edu/Saccharomyces)。釀酒酵母易培養(yǎng)、生活周期短，遺傳背景清晰，同時以釀酒酵母為基礎(chǔ)的分子生物學(xué)研究技術(shù)平臺日趨完善，很容易制備各種突變體等遺傳學(xué)研究材料，使研究方便可行，是理想的真核生物模式種。 高鹽環(huán)境一直是人們關(guān)注的重要的脅迫因子之一，以釀酒酵母為模型開

2、展鹽脅迫機(jī)理研究，在國際上一直是生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。目前，對釀酒酵母脅迫反應(yīng)機(jī)制已經(jīng)有了較深入的了解，高鹽脅迫對酵母細(xì)胞的毒害作用包括兩個方面，一是Na-離子毒害；二是產(chǎn)生滲透壓脅迫，使質(zhì)膜的跨膜滲透壓降低而導(dǎo)致細(xì)胞膨脹壓的喪失。同時，一些重要的鹽脅迫信號傳導(dǎo)途徑和離子通道蛋白相繼被發(fā)現(xiàn)。例如：在高濃度NaCl條件下，高滲透性甘油促分裂原激酶信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑(high osmolarity glycerol mitogen activat

3、ed protein kinase signaling transduction pathway，HOG-MAPK)通過促進(jìn)甘油積累抵抗?jié)B透脅迫刺激。鈣調(diào)磷酸酶(Calcineurin，CaN)信號途徑通過轉(zhuǎn)錄因子Crz1p/Tcn1p激活酵母細(xì)胞ENAI(編碼重要P-型ATPase離子外排泵)的表達(dá)，促進(jìn)Na+外排。同時TRK1/2p負(fù)責(zé)的K+/Na+離子吸收系統(tǒng)，通過提高K+離子親和性，優(yōu)先積累K+限制Na+的吸收，減少對細(xì)胞的毒害

4、作用Na-。本課題組前期利用轉(zhuǎn)座標(biāo)簽隨機(jī)插入突變技術(shù)，首次在釀酒酵母中發(fā)現(xiàn)Bdflp(Bromodomain Transcription Factor 1)轉(zhuǎn)錄因子與高鹽脅迫有關(guān)。 BDF1基因的缺失并不會引起致死效應(yīng)，屬于非基礎(chǔ)性的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。Bdf1p轉(zhuǎn)錄因子在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)上包含：2個“溴”結(jié)構(gòu)域(Bromodomain)和一個位于C末端的ET(Extra-terminal)結(jié)構(gòu)域，屬于BET轉(zhuǎn)錄因子家族。Bromodomain

5、結(jié)構(gòu)域是近10年來發(fā)現(xiàn)的廣泛存在于多種真核生物中的組蛋白賴氨酸乙?；稽c(diǎn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由60～110個高度保守的氨基酸殘基組成，目前對于含Bromodomain結(jié)構(gòu)域蛋白功能的研究還處于起步階段。 本研究利用基因敲除(gene knockout)和化學(xué)藥物阻斷的方法，對鹽脅迫條件下HOG-MAPK途徑、Calcineurin途徑、ENA1基因、以及TRK1基因與BDF1基因之間的遺傳學(xué)關(guān)系進(jìn)行了分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)BDF1基因分

6、別與HOG1、CMP1CMP2、ENA1和TRK1基因同時缺失或阻斷時，酵母細(xì)胞的鹽耐受性均進(jìn)一步減弱，該結(jié)果提示BDF1基因在酵母鹽脅迫應(yīng)答反應(yīng)中與上述途徑/基因可能分別涉及不同的酵母鹽脅迫途徑。 基因表達(dá)譜分析技術(shù)為酵母鹽脅迫反應(yīng)分子機(jī)制及其相關(guān)基因功能的研究提供了全新和有效的研究手段。利用酵母全基因組芯片分別繪制了鹽脅迫條件下野生型菌株和bdflΔ菌株的基因表達(dá)譜，分析比較相互間的不同，在全基因范圍內(nèi)尋找受Bdf1p影響的

7、鹽脅迫反應(yīng)相關(guān)基因。野生型菌株和bdf1Δ菌株細(xì)胞經(jīng)0.6 M NaCI處理45 min后，提取酵母總RNA，合成cDNA并分別用Cy5-dCTP和Cy3-dCTP標(biāo)記，與含有5935個開放閱讀框(open reading frame，ORF)的酵母全基因組芯片進(jìn)行雜交并掃描。采用GenePix Pro 4.0圖像分析軟件(AxonInstruments公司)對芯片圖像進(jìn)行分析，計(jì)算ratio值(兩種熒光強(qiáng)度的比值cy5/cy3)；然后

8、對芯片上的數(shù)據(jù)用Lowess方法進(jìn)行歸一化；最后用T-test和以兩倍差異(即ratio值大于等于2.0，小于等于0.5)的標(biāo)準(zhǔn)來確定差異表達(dá)基因。為了消除熒光偏向性帶來的假陽性，鹽處理和對照的酵母細(xì)胞RNA樣品在反轉(zhuǎn)錄過程中進(jìn)行熒光交換實(shí)驗(yàn)，同時對于每個菌株鹽處理(W303鹽處理_/W303和bdf1Δ鹽處理/bdf1Δ)，都作兩次獨(dú)立的生物學(xué)重復(fù)實(shí)驗(yàn)，分析兩次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中表達(dá)變化趨勢一樣的基因，基因變化的數(shù)值取兩組數(shù)據(jù)的平均值。在此基

9、礎(chǔ)上，隨機(jī)挑選差異表達(dá)的基因，利用實(shí)時熒光定量RT-PCR(real-time quantitativeRT-PCR，qPCR)進(jìn)行驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示對所測定的基因與基因芯片技術(shù)檢測結(jié)果一致，不僅變化方向一致，而且表達(dá)值非常接近，說明芯片結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性。本實(shí)驗(yàn)共篩選出差異表達(dá)基因217個，有144個差異表達(dá)基因分別在野生型菌株與bdf1Δ菌株呈現(xiàn)相同的變化趨勢(上調(diào)基因119個，下調(diào)基因25個)。采用MIPS數(shù)據(jù)庫的在線軟件Fun

10、ctional Catalogue Database(http：//mips.gif.de/proj/funcatDB/search＿main＿fra me.html)進(jìn)行生物學(xué)功能分類對上述144個差異表達(dá)基因進(jìn)行功能分類發(fā)現(xiàn)，以上差異表達(dá)基因主要集中在甘油代謝、海藻糖代謝、離子通道蛋白、氧化脅迫反應(yīng)、熱休克蛋白和功能未知蛋白等方面。其中ENA1基因在野生型菌株和bdf1Δ菌株中的鹽脅迫誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)相似(5.25和6.32)，說明BD

11、F1基因缺失并未對鹽脅迫條件下ENA1基因的正常表達(dá)產(chǎn)生影響，與前面遺傳學(xué)分析結(jié)果一致，即BDF1和ENA1基因分別涉及不同酵母鹽脅迫途徑。同時，基因芯片數(shù)據(jù)顯示甘油合成關(guān)鍵酶基因GPD1(編碼3-磷酸甘油脫氫酶)，經(jīng)鹽脅迫處理后，在野生型菌株和bdf1Δ菌株的基因表達(dá)水平均顯著上升，其誘導(dǎo)表達(dá)倍數(shù)分別高達(dá)35.79和35.52倍。酵母胞內(nèi)甘油含量測定結(jié)果表明，經(jīng)0.6M NaCl處理45 min后，野生型菌株和bdf1Δ菌株中甘油積累

12、均有大幅提高且含量相近，此結(jié)果與上述通過基因芯片在轉(zhuǎn)錄水平上測定結(jié)果一致。 BDF2是釀酒酵母BDF1基因的同源基因，采用長臂同源多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LFH-PCR)方法制備含有遺傳霉素耐藥基因(kanMX4)的BDF2基因敲除片段并轉(zhuǎn)化酵母，構(gòu)建了bdf2Δ菌株。梯度生長實(shí)驗(yàn)表明，與野生型菌株相比，BDF2基因缺失并不造成鹽敏感表型，說明BDF2基因是酵母鹽抗性的非必須基因?；蛐酒Y(jié)果顯示，BDF1基因缺失導(dǎo)致鹽脅迫條件下BDF

13、2基因表達(dá)下調(diào)，提示兩基因間的表達(dá)可能存在相互影響，鹽脅迫條件下兩基因間的遺傳學(xué)關(guān)系有待進(jìn)一步研究。 線粒體是真核生物能量代謝的中心，在物質(zhì)代謝、細(xì)胞凋亡過.程中發(fā)揮了重要的作用?；蛐酒Y(jié)果顯示，經(jīng)0.6M NaCl處理45 min后，與野生型菌株相比，BDF1基因缺失造成鹽脅迫條件下大量線粒體功能相關(guān)基因表達(dá)下降。其中包括：線粒體核糖體基因(MRPL3，MRP4、MRP7和MRP11)，細(xì)胞色素C基因CYC1，線粒體延伸因子

14、基因MEF1和線粒體纈氨酰-tRNA合成酶基因VAS1，該結(jié)果提示，Bdf1p可能在維持鹽脅迫條件下線粒體的正常功能方面發(fā)揮重要作用。線粒體膜電位(Mitochondrial membrane potential，△ψm)和胞內(nèi)活性氧(reactive oxygen species，ROS)含量是評價線粒體功能的的重要指標(biāo)。利用還原型線粒體特異性熒光探針MitoTracker Red CMXRos對鹽脅迫處理后野生型菌株和bdf1Δ菌株

15、中線粒體膜電位的變化進(jìn)行了檢測。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，經(jīng)0.6 M NaCI處理45 min后，Mito Tracker Red CMXRos探針在野生型菌株細(xì)胞中仍處于聚集狀態(tài)，呈現(xiàn)網(wǎng)狀分布的熒光線條，而大約20％左右的bdf1△菌株細(xì)胞呈現(xiàn)彌散狀分布的熒光，說明這些細(xì)胞的線粒體跨膜電位下降或消失。 細(xì)胞凋亡(apoptosis)是指細(xì)胞在一定的外界刺激或病理?xiàng)l件下，受基因控制的一種細(xì)胞自主的有序的死亡。線粒體功能紊亂與酵母細(xì)胞凋亡的