全轉(zhuǎn)錄工程方法(gTME)改良釀酒酵母的初步研究.pdf

1、在不可再生能源資源的日益枯竭，石油價(jià)格屢創(chuàng)新高以及石油燃燒所帶來(lái)的環(huán)境污染，溫室效應(yīng)等一系列問(wèn)題的情況下，生物煉制受到世界各國(guó)的普遍關(guān)注，生物燃料作為一種新興產(chǎn)業(yè)在全球崛起。燃料乙醇被認(rèn)為最有發(fā)展前景的可再生綠色能源之一。釀酒酵母是乙醇生產(chǎn)的主要菌株。
　　 本文從自然界分離得到160株酵母，經(jīng)過(guò)TTC一級(jí)篩選、糖濃度耐性二級(jí)篩選和葡萄糖發(fā)酵三級(jí)篩選獲得7株發(fā)酵性能較好的菌株。對(duì)GX1、GX7、GX140菌株進(jìn)行分子鑒定，結(jié)果表

2、明三株都是酵母屬（Saccharomyces）釀酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）。對(duì)GX7菌株G418抗性實(shí)驗(yàn)表明，在100μ/ml時(shí)菌株不能生長(zhǎng)，初步發(fā)酵性能的研究，產(chǎn)乙醇11.04％。
　　 本研究克隆了釀酒酵母PGK啟動(dòng)子，利用報(bào)告基因-綠色熒光蛋白（GFP）進(jìn)行了活性功能驗(yàn)證，結(jié)果表明PGK啟動(dòng)子具有活性功能。構(gòu)建了含G418抗性篩選標(biāo)記和組成型PGK啟動(dòng)子的載體pYX418。利用全轉(zhuǎn)錄工程（

3、gTME）方法對(duì)野生型釀酒酵母（Saccharomyces scerevisiae）GX7菌株進(jìn)行了改造。
　　 本研究通過(guò)PCR方法克隆獲得釀酒酵母轉(zhuǎn)錄因子spt15基因，與表達(dá)載體pYX418連接，構(gòu)建了重組子pYX418-spt15，并對(duì)SPT15蛋白的177、195和217位點(diǎn)進(jìn)行了定點(diǎn)突變（Phe177Ser、Tyr195His和Lys218Arg），然后醋酸鋰轉(zhuǎn)化入釀酒酵母GX7中，利用不同濃度的G418抗性篩選得到