Neuropilin-1過表達轉基因絨山羊模型的建立及其相關次級毛囊信號通路的研究.pdf

1、神經纖毛蛋白1(Neuropilin-1.NRP-1)是一種跨膜糖蛋白。NRP-1作為一種新型的細胞表面受體，通過介導VEGF通路來促進血管的生成。實驗研究表明，NRP-1主要通過VEGFR-2途徑上調VEGF表達量。在NRP-1敲除的轉基因小鼠模型中發(fā)現(xiàn)血管的形成受到抑制。根據(jù)本實驗室初級毛囊和次級毛囊轉錄組測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在初級毛囊和次級毛囊中NPR-1表達差異為3.16倍?；谝陨犀F(xiàn)象和理論，為了證實NRP-1在次級毛囊生長和發(fā)育中

2、的功能，本研究探討了建立過表達NRP-1轉基因阿爾巴斯白絨山羊模型的技術路線，同時運用質譜分析、免疫共沉淀、Western Bolt、熒光定量PCR、哺乳動物雙雜交系統(tǒng)等技術手段，進一步探究NRP-1在次級毛囊生長中相關信號通路以及其功能。
　　1.NRP-1過表達轉基因阿爾巴斯絨山羊模型的建立
　　構建NRP-1過表達轉基因載體，轉染至阿爾巴斯白絨山羊胎兒成纖維細胞，通過核移植方法，生產過表達NRP-1轉基因阿爾巴斯白絨山

3、羊胚胎。結果成功構建了NRP-1過表達轉基因載體，并且得到了33株陽性NRP-1過表達轉基因單克隆細胞系，用于體細胞核移植的研究。通過核移植得到154枚轉基因克隆胚胎，并移植到55只受體羊中。雖然未得到陽性轉基因羔羊，但是上述結果對于阿爾巴斯白絨山羊轉基因體系的完善及相關動物模型的建立提供了實驗依據(jù)。
　　2.NRP-1相關次級毛囊信號通路的研究
　　由于阿爾巴斯白絨山羊生長周期較長，在建立NRP-1過表達阿爾巴斯轉基因白絨

4、山羊過程中，同步研究了NRP-1在次級毛囊中的信號通路。
　　在次級毛乳頭細胞中利用NRP-1沉淀與NRP-1相互作用的蛋白，通過SDS-PAGE電泳進行蛋白分離。經過考馬斯亮藍染色觀察蛋白條帶，利用蛋白質質譜分析檢測的方法鑒定蛋白的結構。通過查閱文獻和數(shù)據(jù)庫分析，得到Prdx2和CAT是有可能與NRP-1相互作用的蛋白。通過哺乳動物雙雜交系統(tǒng)確認NRP-1與Prdx2存在相互作用的關系。并運用熒光實時定量PCR聯(lián)合蛋白免疫印跡法