內(nèi)皮微粒攜帶的Shh抑制信號在aGVHD內(nèi)皮損傷中的作用機(jī)制研究.pdf

1、第一部分：內(nèi)皮微粒與aGVHD內(nèi)皮損傷的相關(guān)性研究
　　目的：體內(nèi)探討內(nèi)皮微粒與小鼠aGVHD內(nèi)皮損傷的相關(guān)性。
　　方法：以BALB/c小鼠為受鼠，經(jīng)尾靜脈輸注同基因（BALB/c）或異基因（C57BL/6）小鼠的骨髓和脾臟細(xì)胞構(gòu)建 non-aGVHD及 aGVHD小鼠模型，未做移植的BALB/c小鼠作為正常對照，HE染色觀察小鼠肝臟、脾臟、皮膚及小腸的病理改變。在移植前及移植后不同時(shí)間點(diǎn)分批處死小鼠，流式細(xì)胞術(shù)檢測血漿

2、EMPs水平，TUNEL法檢測主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，DHE探針法檢測主動脈活性氧含量，Griess Reagents法檢測血漿一氧化氮濃度。
　　結(jié)果：（1）將C57BL/6小鼠骨髓和脾臟細(xì)胞經(jīng)尾靜脈輸注到BALB/c小鼠成功構(gòu)建了aGVHD小鼠模型。（2）aGVHD組小鼠EMPs水平在移植后至發(fā)生aGVHD時(shí)持續(xù)增高，non-aGVHD組小鼠EMPs水平只在移植后早期出現(xiàn)暫短的升高，移植后aGVHD小鼠 EMPs水平顯著高于 no

3、n-aGVHD組小鼠的水平。（3）aGVHD小鼠移植后至aGVHD發(fā)生當(dāng)時(shí)出現(xiàn)持續(xù)的內(nèi)皮損傷：主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、活性氧含量增加及血漿一氧化氮含量下降，而non-aGVHD小鼠只在移植后早期出現(xiàn)了短暫輕微的內(nèi)皮損傷。
　　結(jié)論：移植后持續(xù)升高的EMPs水平和內(nèi)皮損傷與aGVHD的發(fā)生密切相關(guān)。
　　第二部分：TNF-α誘導(dǎo)的內(nèi)皮微粒在內(nèi)皮損傷中的作用
　　目的：體外初步探討TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷釋放的EMPs在內(nèi)皮

4、損傷中的作用
　　方法：培養(yǎng)原代臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）和臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞系（EA.hy926）, TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷釋放EMPs，流式細(xì)胞術(shù)檢測EMPs水平。提取損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放的EMPs，按不同的濃度（0、5、10、20μg/ml）干預(yù)EA.hy926細(xì)胞，Annexin V FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡，熒光探針DAF-FM DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)一氧化氮含量，Griess Reagents法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清一氧化

5、氮含量，熒光探針DCFH-DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面 ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)，Matrigel膠小管形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞血管生成能力。
　　結(jié)果：（1）TNF-α能明顯誘導(dǎo)HUVEC和EA.hy926細(xì)胞釋放EMPs。（2）損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放的EMPs在高濃度下可以誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及內(nèi)皮功能障礙：EMPs在20μg/ml的濃度開始引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡；在10μg/ml的濃度開始引起內(nèi)皮一氧化氮含量減少，活

6、性氧含量增加，粘附因子ICAM-1、VCAM-1表達(dá)增強(qiáng)和小管形成能力減弱。
　　結(jié)論：內(nèi)皮細(xì)胞損傷釋放的EMPs能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，擴(kuò)大內(nèi)皮損傷信號。
　　第三部分：內(nèi)皮微粒攜帶Shh抑制信號的表達(dá)和傳導(dǎo)
　　目的：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)探討內(nèi)皮微粒攜帶Shh抑制信號表達(dá)和傳導(dǎo)。
　　方法：western blotting檢測allo-HSCT移植后患者及健康正常人血漿微粒的Shh抑制信號（Hip蛋白）表達(dá)水平。免疫組化檢

7、測小鼠主動脈內(nèi)皮細(xì)胞Hip蛋白的表達(dá)。體外用TNF-α誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，western blotting檢測損傷內(nèi)皮細(xì)胞釋放的EMPs攜帶的Hip蛋白水平。將Hip基因特異性siRNA（siRNA-Hip）及對照siRNA（siRNA-NC）轉(zhuǎn)染至EA.hy926細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)定量PCR法和western blotting法分別于轉(zhuǎn)染后的24 h和48h檢測Hip mRNA和蛋白的表達(dá)水平，評估siRNA的沉默效率。按上述方法轉(zhuǎn)染EA.

8、hy926細(xì)胞，經(jīng)TNF-α誘導(dǎo)損傷后提取各組細(xì)胞釋放的EMPs，western blotting檢測 EMPs攜帶的Hip蛋白水平。將 siRNA-NC轉(zhuǎn)染的細(xì)胞釋放的微粒（EMPs）、siRNA-Hip轉(zhuǎn)染的細(xì)胞釋放的微粒（EMPsHip-）以及Shh途徑激動劑（SAG）按以下分組干預(yù)EA.hy926細(xì)胞：正常對照組、EMPs干預(yù)組、EMPsHip-干預(yù)組、EMPs+SAG干預(yù)組。干預(yù)24 h后，實(shí)時(shí)定量PCR和western bl

9、otting分別檢測目的細(xì)胞Hip在mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)。
　　結(jié)果：（1）aGVHD患者血漿微粒Hip蛋白的表達(dá)水平顯著高于non-aGVHD患者以及正常對照組。（2）Hip蛋白在aGVHD小鼠內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá)水平顯著高于non-aGVHD小鼠以及正常小鼠。（3）Hip在TNF-α誘導(dǎo)HUVEC和EA.hy926細(xì)胞損傷釋放的EMPs上的表達(dá)均顯著高于其在靜息狀態(tài)下釋放的EMPs上的表達(dá)。（4）siRNA-Hip轉(zhuǎn)染EA.

10、hy926細(xì)胞可以顯著下調(diào)細(xì)胞及微粒 Hip蛋白的表達(dá)水平，成功制備不攜帶 Hip蛋白的EMPs（EMPsHip-）。（5）EMPs在不影響Hip mRNA表達(dá)的情況下顯著增加目的內(nèi)皮細(xì)胞Hip的蛋白表達(dá)，而EMPsHip-對目的內(nèi)皮細(xì)胞Hip的mRNA和蛋白水平均無顯著影響。
　　結(jié)論：Shh抑制信號與aGVHD的發(fā)生密切相關(guān)；內(nèi)皮細(xì)胞損傷釋放的EMPs攜帶Shh抑制信號并能有效地傳導(dǎo)至目的內(nèi)皮細(xì)胞。
　　第四部分：內(nèi)皮微

11、粒攜帶的Shh抑制信號誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷的作用及機(jī)制研究
　　目的：體外實(shí)驗(yàn)初步探討內(nèi)皮微粒攜帶的Shh抑制信號誘導(dǎo)內(nèi)皮損傷的作用及機(jī)制。
　　方法：按第三部分的方法將siRNA轉(zhuǎn)染至EA.hy926細(xì)胞，制備攜帶Hip蛋白的內(nèi)皮微粒（EMPs）和不攜帶Hip蛋白的內(nèi)皮微粒將（EMPsHip-），按以下分組干預(yù)EA.hy926細(xì)胞：正常對照組、EMPs干預(yù)組、EMPsHip-干預(yù)組、EMPs+SAG干預(yù)組、SAG干預(yù)組。干預(yù)24h

12、或48h后，實(shí)時(shí)定量PCR法檢測Fas、Bcl-2、Bax、eNOS、Ang-1及Ang-2mRNA的表達(dá)水平；western blotting檢測Fas、Bcl-2、Bax、eNOS、p-AKT1、Ang-1及Ang-2蛋白的表達(dá)水平；Annexin V FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡；熒光探針DAF-FM DA染色及Griess Reagents法檢測細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞培養(yǎng)上清一氧化氮含量；熒光探針 DCFH-DA染色檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧含

13、量；流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面 Fas、ICAM-1、VCAM-1的表達(dá)；Matrigel膠小管形成實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞血管生成能力。
　　結(jié)果：（1）EMPs顯著誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，伴隨促凋亡蛋白Bax表達(dá)的上調(diào)以及抗凋亡蛋白 Bcl-2表達(dá)的下調(diào)，EMPsHip-不引起細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白的變化，EMPs+SAG能逆轉(zhuǎn)EMPs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)蛋白變化的作用。（2）EMPs增加細(xì)胞Fas的表達(dá)，但EMPsHip-組及EMPs+SAG組

14、Fas的表達(dá)與正常對照組無明顯變化。（3）EMPs減少內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮的生成、降低eNOS的表達(dá)和p-AKTser473的磷酸化水平，EMPsHip-組及EMPs+SAG組不引起細(xì)胞的一氧化氮含量、eNOS表達(dá)水平以及p-AKTser473磷酸化水平的變化。（4）EMPs損壞內(nèi)皮細(xì)胞小管形成能力伴隨Ang-1表達(dá)的下調(diào)和Ang-2表達(dá)的上調(diào)，同樣EMPsHip-組及EMPs+SAG組細(xì)胞的小管形成能力和Ang-1、Ang-2的表達(dá)和正常