阻斷TRPV4抑制大鼠無菌性心包炎模型心房纖維化及心房顫動的發(fā)作.pdf

1、本文分為以下幾個部分:
　　第一部分：TRPV4參與大鼠無菌性心包炎模型心房顫動的發(fā)生
　　目的：建立穩(wěn)定的大鼠無菌性心包炎心房顫動（房顫）模型，觀察TRPV4在無菌性心包炎模型大鼠心房組織中的表達(dá)及功能變化。給予TRPV4口服抑制劑GSK2193874治療無菌性心包炎模型大鼠，觀察房顫的發(fā)生率及持續(xù)時間有無變化。收集臨床接受主動脈旁路移植術(shù)的房顫患者及竇性心律患者的心房組織標(biāo)本，檢測二者TRPV4表達(dá)有無差異，進(jìn)一步明確T

2、RPV4與房顫之間的關(guān)系。
　　方法：在大鼠心房表面均勻播撒無菌性滑石粉，建立大鼠無菌性心包炎房顫模型。在手術(shù)后的不同時間點（1d，2d，3d，4d，5d，7d，14d），運用western blot技術(shù)，檢測心房及心室組織TRPV4通道蛋白的表達(dá)變化。同時，采集各組大鼠心房組織做冰凍切片，進(jìn)行免疫熒光染色，觀察TRPV4通道的表達(dá)及分布有無變化。將SD大鼠隨機(jī)分為3組：sham組；vehicle組（給予等量6％羥丙基-β-環(huán)糊精

3、灌胃處理）；GSK2193874組（給予TRPV4特異性阻斷劑GSK219387410mg/kg灌胃治療）。在手術(shù)后第3d，應(yīng)用大鼠食道調(diào)搏技術(shù)，記錄各組大鼠文氏點、竇房結(jié)恢復(fù)時間、房顫誘發(fā)率及房顫持續(xù)時間等指標(biāo)，并比較各組之間有無差異。收集臨床接受冠狀動脈旁路移植術(shù)的竇性心律及房顫患者的心房組織，western blot技術(shù)檢測二者心房TRPV4表達(dá)水平有無差異。
　　結(jié)果：無菌性心包炎手術(shù)后第1d，2d，3d，4d，5d，7d

4、，14d,大鼠心房組織TRPV4蛋白表達(dá)量持續(xù)高于sham組，在術(shù)后第1d達(dá)高峰；手術(shù)后第14d，TRPV4蛋白表達(dá)量有所下降，但依然顯著高于sham組。各組大鼠心室組織TRPV4蛋白表達(dá)水平未見明顯改變。免疫熒光結(jié)果顯示，sham組大鼠心房組織TRPV4主要分布于細(xì)胞核周圍，細(xì)胞膜上TRPV4表達(dá)很少；而無菌性心包炎模型組大鼠心房組織中，TRPV4在細(xì)胞膜上的表達(dá)量顯著增多。電生理檢測結(jié)果顯示，vehicle組大鼠房顫持續(xù)時間與房顫誘

5、發(fā)率顯著高于sham組；GSK2193874組大鼠房顫的持續(xù)時間及誘發(fā)率則顯著下降。臨床患者心房組織檢測結(jié)果顯示，房顫患者心房組織TRPV4含量顯著高于竇性心律患者。
　　結(jié)論：TRPV4通道參與大鼠無菌性心包炎模型房顫發(fā)作，阻斷TRPV4可有效抑制大鼠無菌性心包炎模型房顫發(fā)作；TRPV4可能參與臨床房顫患者的病理進(jìn)程，阻斷TRPV4有望成為臨床治療房顫的新靶點。
　　第二部分：阻斷TRPV4可抑制大鼠心房成纖維細(xì)胞增殖及分

6、化
　　目的：心房纖維化參與房顫發(fā)生，TRPV4是否通過誘導(dǎo)心房纖維化進(jìn)而參與房顫發(fā)作，至今尚未見相關(guān)研究報道。本實驗擬通過利用大鼠無菌性心包炎房顫模型，探討TRPV4在心房纖維化中的作用及其潛在的分子機(jī)制。
　　方法：SD大鼠隨機(jī)分為3組：sham組；vehicle組（給予等量6%羥丙基-β-環(huán)糊精灌胃處理）；GSK2193874組（給予TRPV4特異性阻斷劑GSK219387410mg/kg灌胃治療）。于無菌性心包炎手術(shù)

7、前1d，給予vehicle組及GSK2193874組大鼠體重比例的溶劑或阻斷劑處理，持續(xù)至SP手術(shù)后第2d。SP手術(shù)后第3d處死大鼠，留取左、右心房標(biāo)本備用。Real Time PCR技術(shù)檢測各組大鼠心房組織纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF-β1、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA表達(dá)變化。Masson染色檢測各組大鼠心房組織膠原含量，免疫組化染色檢測心房a-SMA表達(dá)變化。Western blot技術(shù)檢測大鼠心房組織纖維化相關(guān)信號通路蛋

8、白STAT3、AKT/GSK-3心、ERK表達(dá)水平有無改變。分離培養(yǎng)各組大鼠心房成纖維細(xì)胞，使用多功能酶標(biāo)儀檢測TRPV4激動劑GSK1016790A引起的細(xì)胞鈣離子內(nèi)流有無差異。預(yù)先給予TRPV4通道特異性阻斷劑GSK2193874孵育心房成纖維細(xì)胞，再觀察GSK1016790A引起的鈣離子內(nèi)流有無變化。運用膜片鉗技術(shù)記錄各組大鼠心房成纖維細(xì)胞TRPV4通道給藥前及給予GSK1016790A時的電流大小，比較兩組心房成纖維細(xì)胞TRPV

9、4電流有無差異。分離培養(yǎng)的大鼠成纖維細(xì)胞，阻斷或激動TRPV4，RT-PCR檢測纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF-β、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA水平有無變化；阻斷AKT、STAT3信號通路，檢測激動TRPV4后成纖維細(xì)胞上述纖維化指標(biāo)有何變化。
　　結(jié)果：Real Time PCR結(jié)果顯示，vehicle組大鼠心房組織纖維化相關(guān)指標(biāo)TGF-β、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA表達(dá)水平顯著高于Sham組。Masso

10、n染色與免疫組化染色結(jié)果顯示，Control組大鼠心房組織膠原及a-SMA含量顯著高于Sham組。GSK2193874組大鼠心房組織纖維化指標(biāo)的表達(dá)量顯著降低。Western blot結(jié)果顯示，vehicle組大鼠心房組織纖維化相關(guān)信號通路蛋白STAT3、AKT、GSK-3S的磷酸化水平顯著高于sham組；阻斷TRPV4后，GSK2193874組大鼠心房STAT3、AKT、GSK-3S蛋白的磷酸化水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；各組大

11、鼠心房ERK表達(dá)水平未見明顯改變。胞內(nèi)鈣檢測結(jié)果顯示，Vehicle組大鼠心房成纖維細(xì)胞對TRPV4激動劑GSK1016790A的反應(yīng)性顯著高于sham組。應(yīng)用TRPV4特異性阻斷劑GSK2193874預(yù)先處理細(xì)胞后，GSK1016790A引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流可被有效抑制。膜片鉗結(jié)果顯示，給予TRPV4激動劑灌注時，SP大鼠心房成纖維細(xì)胞TRPV4電流升高幅度顯著高于sham組細(xì)胞。細(xì)胞實驗顯示，激動TRPV4后，成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)

12、指標(biāo)TGF-β、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、a-SMA的mRNA水平顯著增高，而抑制TRPV4則可有效抑制纖維化指標(biāo)的mRNA表達(dá)水平。此外，在細(xì)胞水平阻斷AKT、STAT3通路，可有效抑制TRPV4激動引起的致纖維化效應(yīng)。
　　結(jié)論：無菌性心包炎模型大鼠心房成纖維細(xì)胞TRPV4功能增強(qiáng)，參與心房纖維化的形成；阻斷TRPV4可有效抑制心房組織纖維化病理改變。TRPV4激活后，可能通過上調(diào)AKT/GSK-3β、STAT3磷酸化水平，促進(jìn)

13、成纖維細(xì)胞增殖分化及膠原合成，誘導(dǎo)心房纖維化，進(jìn)而參與房顫發(fā)生。
　　第三部分:阻斷TRPV4對無菌性心包炎模型大鼠心房電重構(gòu)的影響
　　目的：心臟電重構(gòu)在房顫中的作用已經(jīng)被明確，本部分實驗擬通過大鼠無菌性心包炎模型，研究TRPV4在心臟電重構(gòu)中的作用及其潛在的可能機(jī)制。
　　方法：SD大鼠隨機(jī)分為3組：sham組；vehicle組（給予等量6%羥丙基-β-環(huán)糊精）；GSK2193874組（給予TRPV4特異性阻斷劑G

14、SK219387410mg/kg）。于無菌性心包炎手術(shù)前1d，給予vehicle組及GSK2193874組大鼠體重比例的溶劑或阻斷劑灌胃處理，持續(xù)至手術(shù)后第2d。在手術(shù)后第3天，分離各組大鼠心臟并用Langendorff灌流系統(tǒng)進(jìn)行灌流，使用MappingLab系統(tǒng)檢測大鼠左心房在7Hz刺激下的傳導(dǎo)速度及傳導(dǎo)異質(zhì)性。隨后，記錄大鼠右心房7Hz刺激下動作電位時程。所有檢測完成后，留取大鼠心房組織標(biāo)本：Western blot技術(shù)檢測各組大

15、鼠心房組織電傳導(dǎo)相關(guān)蛋白縫隙連接蛋白43（connexin43）、小凹蛋白-3（caveolin-3）的表達(dá)變化；免疫組織化學(xué)染色法檢測各組大鼠心房組織connexin43分布情況。
　　結(jié)果：Mapping檢測結(jié)果顯示，vehiclel組大鼠心房組織傳導(dǎo)模式紊亂，傳導(dǎo)異質(zhì)性顯著增加；而阻斷TRPV4后，GSK2193874組大鼠心房傳導(dǎo)模式趨向正常，傳導(dǎo)異質(zhì)性顯著降低。動作電位記錄結(jié)果顯示，vehicle組大鼠心房組織單向動作電

16、位時程（APD）顯著延長，阻斷TRPV4后，GSK2193874組大鼠心房APD縮短至正常水平。Western blot結(jié)果顯示，vehiclel組大鼠心房組織caveolin-3表達(dá)水平顯著低于sham組，而GSK2193874組大鼠心房組織caveolin-3恢復(fù)至正常水平。免疫組化染色結(jié)果顯示：sham組大鼠心房組織connexin43主要分布于心肌細(xì)胞閏盤處，很少見側(cè)邊化分布；而vehicle組大鼠心房組織connexin43出