單體紅色熒光蛋白基因DsRed2的克隆、原核表達(dá)特性及其生物信息分析.pdf

1、本研究用從質(zhì)粒pDsRed2-1中分離的紅色熒光蛋白基因DsRed2構(gòu)建了原核表達(dá)載體pGEX4T-1-DsRed2，進(jìn)行了原核表達(dá)，并對目的蛋白的生物信息進(jìn)行了分析，結(jié)果表明:
　　1、從質(zhì)粒pDsRed2-1中分離的含有紅色熒光蛋白基因DsRed2的目標(biāo)DNA片段，序列長度為680bp，含有678bp構(gòu)成的開放閱讀框(ORF)。與參考序列Ref_DsRed2-DNA相比，所克隆的含有目的基因DsRed2的DNA片段在其ORF內(nèi)

2、，從起始密碼子的第1個(gè)堿基起，下游第537個(gè)堿基由C突變?yōu)門，使第179個(gè)密碼子從TCC(UCC)變?yōu)門CT(UCU)，兩者的序列一致性為99.85％。克隆的含有目的基因DsRed2的DNA片段在其ORF內(nèi)存在的單堿基突變屬于同義突變，所編碼的目的蛋白氨基酸序列不變，序列一致性為100％。
　　2、目的基因DsRed2編碼由225個(gè)氨基酸組成的蛋白RFP2;該蛋白屬于熒光蛋白超級家族。該蛋白無信號肽，不涉及合成后的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　

3、　3、RFP2蛋白氨基酸序列包含5個(gè)疏水區(qū)和5個(gè)親水區(qū)，前者都比較小、且由弱親水部分所構(gòu)成，而后者都很大、且由強(qiáng)親水部分所構(gòu)成;該蛋白親水性氨基酸殘基數(shù)量是疏水性氨基酸殘基數(shù)量的2.2倍，其總親疏水性值為-129.9;該蛋白的氨基酸序列經(jīng)高級折疊形成的疏水內(nèi)核較小，疏水性氨基酸殘基被裸露于外部的親水性氨基酸殘基所包埋、大部分序列構(gòu)成了親水表面、形成親水的蛋白顆粒。
　　4、利用目標(biāo)DNA片段構(gòu)建的DsRed2的原核表達(dá)載體pGEX

4、4T-1-DsRed2，目的基因DsRed2正確插入到原核表達(dá)載體pGEX4T-1的GST標(biāo)簽基因的下游，目的基因DsRed2與GST標(biāo)簽基因形成無移碼突變的可連續(xù)閱讀的開放閱讀框，兩者構(gòu)成GST-DsRed2融合基因。
　　5、DsRed2基因不僅在表達(dá)菌株BL21(DE3)中能夠表達(dá)，而且在克隆菌株DH5α中也能夠表達(dá)。在BL21(DE3)中RFP2的表達(dá)量，在1～5h范圍內(nèi)，隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長而迅速增加，此后增加不明顯;誘導(dǎo)3