團頭魴β--防御素1對巨噬細胞趨化效應研究.pdf

1、β-防御素(3-defensin，BD)是一種富含半胱氨酸具有廣譜抗菌活性的陽離子短肽。目前研究發(fā)現(xiàn)，BD可以趨化免疫細胞遷移，在機體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。本研究通過對團頭魴β-防御素1(MaBDl)進行表達和純化，獲得團頭魴β-防御素1重組蛋白，研究其對團頭魴白細胞，尤其是巨噬細胞的趨化作用和炎癥細胞因子表達的影響。實驗結(jié)果如下:
　　1.構(gòu)建原核重組表達載體pET-32a-MaBD1，通過IPTG誘導表達MaBD1重組融合蛋

2、白。將該蛋白利用Ni2+親和層析方法純化后，再經(jīng)腸激酶酶切及純化，獲得MaBD1重組蛋白。使用MaBD1重組蛋白進行抑菌實驗，結(jié)果顯示MaBD1重組蛋白對大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和金黃色葡萄球菌具有明顯的抑菌活性。
　　2.采用Percoll非連續(xù)梯度離心法分離團頭魴頭腎白細胞，再利用貼壁方法分離純化巨噬細胞，采用光鏡和透射電子顯微鏡進行鑒定，結(jié)果顯示:團頭魴頭腎白細胞主要包括:中性粒細胞、單核/巨噬細胞和淋巴細胞。貼壁巨噬細胞鋪展

3、或伸長呈各種形狀，細胞核圓形和橢圓形，多數(shù)偏于細胞一側(cè)。巨噬細胞表面標志CD68在貼壁巨噬細胞中高表達。
　　3.用Transwell法檢測MaBD1的體外趨化活性，發(fā)現(xiàn)MaBD1重組蛋白對白細胞，尤其是巨噬細胞具有明顯趨化作用。為進一步了解MaBD1趨化功能位點，分別合成N端(MaBDPl)和C端(MaBDP2)MaBD1多肽，N端的趨化活性顯著高于C端。
　　4.將MaBDPl注射團頭魴腹腔，觀察MaBDP1對體內(nèi)白細胞

4、以及巨噬細胞趨化活性，結(jié)果顯示MaBDP1對體內(nèi)白細胞和巨噬細胞都有趨化作用。在2d500ng/mL MaBDP1對白細胞具有趨化作用。而在3d1000ng/mL MaBDP1對巨噬細胞趨化作用明顯。qPCR檢測MaBDP1對促炎細胞因子（IL-1β和TNF-α）表達影響結(jié)果顯示:脾臟，頭腎和體腎中IL-1β表達量在6h和72h表達量顯著升高，肝胰腺中IL-1β表達量在6h表達量顯著升高;脾臟，頭腎和體腎中TNF-α表達量在72h顯著升