獲得性重型再生障礙性貧血患者外周血淋巴細(xì)胞穿孔素基因突變檢測(cè)及mRNA表達(dá)分析.pdf

1、目的：檢測(cè)獲得性重型再生障礙性貧血(SAA)患者外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA穿孔素基因(PRF)編碼序列突變形式及rs882822 SNP位點(diǎn)基因型、等位基因分布特點(diǎn)；檢測(cè)SAA患者外周血淋巴細(xì)胞穿孔素mRNA表達(dá)水平，探索穿孔素基因與SAA發(fā)病之間的相關(guān)關(guān)系。
　　 方法：應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法擴(kuò)增31例SAA患者及15名正常對(duì)照外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA穿孔素基因(PRF1)外顯子2(EXON2)及外顯子3(EXON3

2、)，雙脫氧終止法測(cè)序，用generunner-軟件將所得序列與GenBank報(bào)道序列核對(duì)尋找基因突變位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)有突變序列將基因組克隆入M13噬菌體載體中，對(duì)所得兩條染色體相應(yīng)序列分別測(cè)序，以確定不同突變?cè)谌旧w上的分布；根據(jù)測(cè)序峰圖核對(duì)rs885822 SNP位點(diǎn)基因型分布，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算rs885822SNP位點(diǎn)基因型分布是否符合遺傳平衡(哈代-韋伯格平衡)，應(yīng)用卡方檢驗(yàn)方法計(jì)算rs885822 SNP位點(diǎn)基因型及等位基因頻

3、率在SAA患者和正常對(duì)照是否存在差異；應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)方法提取SAA患者外周血淋巴細(xì)胞mRNA，PCR擴(kuò)增穿孔素mRNA，瓊脂糖凝膠電泳，gel pro軟件進(jìn)行半定量分析。獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)方法比較SAA患者與正常人外周血淋巴細(xì)胞穿孔素mRNA表達(dá)是否存在差異。
　　 結(jié)果：通過(guò)對(duì)31例SAA患者及15名正常人的外周血淋巴細(xì)胞基因組DNA穿孔素基因外顯子2和外顯子3直接測(cè)序，在一例女性SAA患者發(fā)現(xiàn)有822位C>T堿

4、基突變，突變類(lèi)型為純合子突變，此堿基突變對(duì)氨基酸序列無(wú)影響。在一例男性SAA患者，發(fā)現(xiàn)907位G>A堿基突變，突變類(lèi)型為雜合子突變，對(duì)氨基酸序列的影響為303位甲硫氨酸變成纈氨酸(Met303Val)。在正常人中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)存在突變樣本；發(fā)現(xiàn)一處單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)(SNP)此位點(diǎn)已由SNP數(shù)據(jù)庫(kù)報(bào)道，編號(hào)rs885822。此位點(diǎn)的分布符合哈代-韋伯格平衡(P>0.05)，此位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布在病例組與對(duì)照組之間有明顯差異(P=0.