不同時期離心力對小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向軟骨分化的實驗研究.pdf

1、目的：
　　觀察小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞微團培養(yǎng)成軟骨分化過程中，不同時期離心力對其的作用，探討力學(xué)因素與Notch信號通路在軟骨分化過程中的作用機制。
　　方法：
　　昆明小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離，多次換液傳代培養(yǎng)至第3代，進行細(xì)胞表型鑒定，以1×106細(xì)胞量制作成細(xì)胞微團。按處理因素的不同將試驗分為5組：A組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第1周離心處理；B組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第2周離心處理；C組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第3周離心處理；D組：誘導(dǎo)培養(yǎng)第4周離心處

2、理；E組：靜態(tài)培養(yǎng)，期間未進行離心處理。實驗采用Eppendorf5920 R恒溫離心機提供37℃，200G，2h/d相對離心力，每周換液2次。在相應(yīng)處理后于第7、14、21、28日采用CCK-8法和PCNA標(biāo)記法檢測離心處理后細(xì)胞與對照組細(xì)胞的增殖效率， RT-PCR分析 Sox9,Col-Ⅱ,及Notch信號通路相關(guān)分子表達。Elisa法測定每次換液后各組培養(yǎng)基內(nèi)Col-Ⅱ的蛋白含量。28天后，番紅O染色檢測各組ECM，免疫熒光檢測

3、各組Col-Ⅱ表達。
　　結(jié)果：
　　1.原代細(xì)胞呈類圓形，24小時后可見少許貼壁，傳代后細(xì)胞呈長梭形，生長迅速，細(xì)胞集落形成，呈漩渦狀生長。流式細(xì)胞儀鑒定為CD45陽性表達，CD11b, CD34,CD29陰性表達。細(xì)胞純度高，為間充質(zhì)干細(xì)胞表型。
　　2.細(xì)胞增殖率檢測：A,B組較對照組細(xì)胞增殖明顯，C,D組細(xì)胞增殖效率與對照組沒有顯著差異。
　　3.RT-PCR檢測：誘導(dǎo)28天后Sox9與Col-Ⅱ表達相一

4、致，B,C組表達較對照組增高，A組較對照組降低，D組無明顯差異。Notch1和Hey1表達相一致，B,C組均較對照組降低；A,D組均升高。Hes1表達各組間沒有明顯差異。A組離心7天后（第1周末）與對照組相比，Sox9與Col-Ⅱ表達均降低（P<0.05），Notch1與Hey1表達均增高（P<0.05）；B組離心7天后（第2周末）與對照組相比，Sox9與Col-Ⅱ表達明顯增高（P<0.05），Notch1與Hey1表達降低（P<0.0

5、5）；C組離心7天后（第3周末）與對照組相比，Sox9與 Col-Ⅱ表達明顯增高（P<0.05），Notch1與Hey1表達降低（P<0.05）。
　　4.培養(yǎng)基中Col-Ⅱ的濃度隨著誘導(dǎo)時間呈現(xiàn)增長趨勢，與對照組相比，A組分泌Col-Ⅱ受到抑制，分化延遲，且終濃度較低；B組誘導(dǎo)效果最明顯，Col-Ⅱ早期分泌，且終濃度最高；C組誘導(dǎo)效果亦顯著，終濃度與B組相當(dāng)；D組誘導(dǎo)效果無差異。
　　5.番紅O及免疫熒光染色顯示各誘導(dǎo)組均