蛋白質(zhì)的毛細(xì)管陣列液相色譜分離及相互作用新方法研究.pdf

1、隨著人類基因組計(jì)劃的完成，生命科學(xué)研究進(jìn)入了后基因組時(shí)代，即蛋白質(zhì)組學(xué)的研究。蛋白質(zhì)組學(xué)中有兩條技術(shù)路線：一條是基于肽段的“bottom-up”，另一條是基于蛋白質(zhì)水平的“top-down”?；诘鞍踪|(zhì)水平的分離鑒定能夠獲得蛋白質(zhì)完整的信息，使蛋白質(zhì)的定量、蛋白與蛋白相互作用以及翻譯后修飾研究更加高效可靠。因此，對(duì)蛋白質(zhì)水平的分離鑒定成為近幾年的研究主流方向。然而，蛋白質(zhì)比肽段復(fù)雜得多。如何采用高效、高通量、高分辨的分離手段，實(shí)現(xiàn)對(duì)一個(gè)

2、復(fù)雜蛋白質(zhì)組在蛋白質(zhì)水平上的有效分離給色譜工作者提出了一個(gè)新的挑戰(zhàn)。構(gòu)建高通量的陣列式多維液相色譜平臺(tái)成為極具潛力的大規(guī)模蛋白質(zhì)組學(xué)樣品分析的關(guān)鍵。
　　 在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，闡明蛋白質(zhì)間的相互作用是最有挑戰(zhàn)性而又重要的任務(wù)之一。研究蛋白質(zhì)相互作用的方式和程度，將有助于蛋白質(zhì)功能的分析、疾病致病機(jī)理的闡明和治療以及新型藥物的開發(fā)等眾多難題的解決，因此，確定蛋白質(zhì)間相互作用關(guān)系、繪制相互作用圖譜已成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)?，F(xiàn)有的技

3、術(shù)研究周期長、成本高、代價(jià)昂貴，限制了對(duì)蛋白質(zhì)相互作用高通量、高效的研究。
　　 本論文針對(duì)蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)難點(diǎn)問題，研制了新型的蛋白質(zhì)捕集柱，搭建了蛋白質(zhì)水平分離的兩維陣列式毛細(xì)管液相色譜平臺(tái)，建立了基于蛋白質(zhì)固定與蛋白質(zhì)熒光標(biāo)記的研究蛋白質(zhì)相互作用的新方法，對(duì)正常及高脂大鼠的鼠肝提取蛋白進(jìn)行了基于質(zhì)譜的無標(biāo)記定量分析。全文共分五章，主要內(nèi)容如下：
　　 第一章，文獻(xiàn)綜述。本章總結(jié)了整體柱的發(fā)展概況及整體柱在微

4、分離分析領(lǐng)域的應(yīng)用，概述了多維液相色譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)展，介紹了蛋白質(zhì)相互作用的研究方法。闡述了本論文的選題意義。
　　 第二章，商品捕集柱以及我們已研制的捕集柱主要用于肽水平樣品的捕集，無法滿足蛋白質(zhì)水平的樣品餾分高效捕集與洗脫。論文采用溶膠凝膠法制備了新型的蛋白質(zhì)捕集柱并成功地對(duì)實(shí)際鼠肝蛋白質(zhì)進(jìn)行了高效捕集與洗脫。首先通過優(yōu)化溶膠凝膠的配方及改善工藝條件，制得了由薄層溶膠凝膠涂覆的蛋白質(zhì)捕集柱。柱與柱之間，批次與批次

5、之間重現(xiàn)性好，同時(shí)捕集柱保持了較高的機(jī)械強(qiáng)度。然后將該捕集柱應(yīng)用于在線捕集-分離檢測(cè)的毛細(xì)管液相色譜系統(tǒng)，以四種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的混合物為研究對(duì)象，考察了捕集柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的回收率、最大上樣量、柱子的重現(xiàn)性等參數(shù)。一根5mm長的捕集柱對(duì)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的平均回收率為99.3％，對(duì)四種蛋白質(zhì)混合物的最大上樣量為30μg。最后該在線捕集-分離檢測(cè)的毛細(xì)管液相系統(tǒng)成功用于實(shí)際鼠肝提取蛋白的在線除鹽、捕集，獲得了滿意的結(jié)果。
　　 第三章，搭建了蛋

6、白質(zhì)水平分離的陣列式毛細(xì)管二維液相色譜分離技術(shù)平臺(tái)，將上述研制的蛋白質(zhì)捕集柱應(yīng)用于蛋白的在線除鹽、富集，對(duì)鼠肝組織的蛋白質(zhì)組進(jìn)行了高效分離。在此基礎(chǔ)上，采用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的靶上酶解技術(shù)，對(duì)分離后的蛋白質(zhì)進(jìn)行酶解，將蛋白質(zhì)高通量的分離與MALDI-TOF-TOF-MS檢測(cè)有效的結(jié)合起來，從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)從分離、酶解到鑒定這樣一個(gè)完整的“top-down”路線分析。該平臺(tái)以強(qiáng)陰離子交換色譜(SAX)為第一維色譜分離模式，以十八根并行式的反相液

7、相色譜(RPLC)為第二維分離模式，可快速完成進(jìn)樣、除鹽富集、分離、酶解及鑒定，實(shí)現(xiàn)真正的蛋白質(zhì)組學(xué)研究所需的高通量分析。SAX柱采用階梯式鹽梯度洗脫，蛋白質(zhì)樣品經(jīng)過0.5mm內(nèi)徑SAX柱分離之后，洗脫下來的餾分通過兩個(gè)十通閥的切換被依次保留在18根自制蛋白捕集柱的柱頭，對(duì)樣品進(jìn)行在線除鹽、捕集。餾分經(jīng)捕集柱捕集除鹽后，通過一個(gè)十八通道分流器，被并行反沖到陣列式的毛細(xì)管反相柱上進(jìn)行第二維分離。樣品分析通量提高了18倍。利用自動(dòng)點(diǎn)樣儀將經(jīng)

8、過RPLC的洗脫液直接收集到MALDI靶板上，點(diǎn)樣頻率為1分鐘/次，經(jīng)過靶上單點(diǎn)酶解之后用MALDI-TOF-TOF-MS鑒定。整個(gè)系統(tǒng)對(duì)鼠肝蛋白進(jìn)行了分離鑒定，共鑒定出1030種蛋白質(zhì)。
　　 第四章，探索了研究蛋白質(zhì)相互作用的新方法。將目標(biāo)蛋白質(zhì)固定在氨基材料上，將與之發(fā)生相互作用的蛋白質(zhì)進(jìn)行固相熒光衍生，然后將兩者孵育，洗脫后，用熒光顯微鏡進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)及其抗體對(duì)該方法的可行性進(jìn)行了驗(yàn)證，該方法有望

9、應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)相互作用，實(shí)現(xiàn)對(duì)大量蛋白質(zhì)高通量的篩選。首先合成了氨基納米磁性微球，通過化學(xué)反應(yīng)在氨基磁球上連接上戊二醛，然后將蛋白質(zhì)連接到戊二醛上，實(shí)現(xiàn)了在氨基納米磁球上固定蛋白質(zhì)。通過比較蛋白質(zhì)溶液與材料反應(yīng)前后對(duì)280nm紫外光的吸收強(qiáng)度，可以估算出磁球表面固定蛋白的量。然后采用本實(shí)驗(yàn)室發(fā)展的固相熒光衍生法，在毛細(xì)管中制備了用于蛋白熒光標(biāo)記的固相載體填充床，以熒光素異硫氰酸酯(FITC)作為熒光衍生試劑，實(shí)現(xiàn)了蛋白的固相熒光衍生。

10、并自行填充了毛細(xì)管體積排阻色譜柱，對(duì)過量熒光試劑進(jìn)行了有效去除。將固定在氨基材料上的GST與標(biāo)記上熒光的GST抗體在Tris-HCl緩沖液(pH7.5，100mM NaCl，4℃)中過夜孵育、洗脫后，在熒光顯微鏡下觀察，材料上可見熒光。應(yīng)用該方法對(duì)固定在氨基材料上的人血清蛋白(HSA)與標(biāo)記上FITC的血漿餾分之間的相互作用進(jìn)行了初步探索。
　　 第五章，采用APEX方法，建立了無標(biāo)記的納流毛細(xì)管液相色譜-電噴霧離子阱串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)

11、用分析鑒定正常及高脂鼠肝組織中的差異蛋白。將20周齡正常及高脂鼠肝組織提取蛋白酶解后的肽段使用強(qiáng)陽離子交換/反相納升級(jí)液相色譜(SCX/nano HPLC)進(jìn)行電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜分析(ESI-MS-MS)。分析步驟如下：肽段干粉使用60μL上樣液(5mM甲酸銨，5％ACN水溶液，pH3.0，第一個(gè)濃度的鹽梯度)溶解后每次上樣19μL。第一維上樣流速為20μL/min，洗脫5分鐘，未被SCX保留的肽段直接被捕集柱捕集，同時(shí)經(jīng)過捕集柱的鹽溶液直

12、接排入廢液。經(jīng)過閥切換，使捕集柱和分析柱相連，同時(shí)啟動(dòng)Nano泵進(jìn)行反相分離，啟動(dòng)質(zhì)譜采集在線檢測(cè)肽段。進(jìn)樣器吸取20μL第二種濃度的鹽溶液進(jìn)行第二個(gè)鹽梯度，重復(fù)進(jìn)行以上步驟。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行10個(gè)鹽梯度(包括第一次上樣的梯度)。鹽梯度之后仍會(huì)有部分疏水性較強(qiáng)的肽段保留在SCX柱上，為了回收這部分肽段，最后我們添加了一個(gè)ACN濃度較高的鹽梯度。對(duì)串級(jí)質(zhì)譜鑒定的數(shù)據(jù)庫分析后，高脂鼠肝組織中的蛋白與正常鼠肝組織中的相比，含量兩倍上調(diào)的有21種，兩