鞘磷脂合酶異常表達(dá)與細(xì)胞凋亡關(guān)系的探討.pdf

1、鞘磷脂合酶是催化鞘磷脂生物合成的最后一步的關(guān)鍵酶,它以神經(jīng)酰胺和卵磷脂為底物,催化形成鞘磷脂和甘油二酯。鞘磷脂合酶在人體有兩種異構(gòu)體,分別稱為SMS1和SMS2,SMS1主要存在于高爾基體,SMS2主要存在于細(xì)胞膜。為判斷SMS與細(xì)胞凋亡的關(guān)系,我們用pcDNA-SMS1和pcDNA-SMS2轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞,構(gòu)建成分別穩(wěn)定高表達(dá)SMS1和SMS2的細(xì)胞模型(CHO-SMS1和CHO-SMS2)。Lysenin細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)和DilC16標(biāo)記

2、細(xì)胞膜實(shí)驗(yàn)表明,與野生型CHO細(xì)胞相比,CHO-SMS1和CHO-SMS2細(xì)胞膜有更高的鞘磷脂含量,也具有更多的去垢劑不溶性膜成分。流式細(xì)胞檢測(cè),細(xì)胞caspase-3mRNA水平及蛋白水平檢測(cè)結(jié)果表明,TNFα刺激后的CHO-SMS1和CHO-SMS2細(xì)胞出現(xiàn)比野生型細(xì)胞更高的細(xì)胞凋亡。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)脂類含量表明,CHO-SMS1和CHO-SMS2細(xì)胞內(nèi)鞘磷脂、神經(jīng)酰胺、甘油二酯的含量以及神經(jīng)酰胺:鞘磷脂比率均顯著性升高,而卵磷脂含量

3、無明顯改變。我們繼續(xù)用siRNA干擾THP-1來源的巨噬細(xì)胞(TDMC),SMS1或SMS2siRNA干擾可顯著性降低TDMC細(xì)胞的SMS酶比活性,并抑制LPS誘導(dǎo)的TDMC細(xì)胞凋亡。脂類測(cè)定表明,TDMC分別經(jīng)各種siRNA處理和LPS刺激后,與對(duì)照組細(xì)胞相比,SMS1siRNA或SMS2siRNA干擾的TDMC細(xì)胞內(nèi)SM和DAG都顯著性下降,而卵磷脂和神經(jīng)酰胺的含量以及神經(jīng)酰胺:鞘磷脂比率均無顯著性改變。Lysenin細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)表明

4、,SMS干擾后的TDMC細(xì)胞膜鞘磷脂含量下降。而用免疫熒光流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定表明,SMS的干擾抑制了LPS刺激后TDMC細(xì)胞膜TLR4/MD2復(fù)合體的形成。我們的實(shí)驗(yàn)表明,在CHO細(xì)胞中,SMS的高表達(dá),可能通過神經(jīng)酰胺的含量增高促進(jìn)TNFα誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,但不排除DAG升高激活新型PKC介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)的可能。而在TDMC細(xì)胞中,SMS的敲減可能影響脂筏的功能、減少TLR4/MD2受體復(fù)合體的形成抑制了LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,也可能通過DAG