PPHN大鼠模型中PPAR-γ調(diào)節(jié)肺血管重塑的機(jī)制研究.pdf

1、目的：新生兒持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓(persisent pulmonary hypertension of the newborn，PPHN)主要病理變化以前期可逆的肺血管收縮和后期不可逆的肺血管重塑為主要特征，肺血管重塑以血管中層滑肌細(xì)胞的增殖最為突出。眾多因素可以引起肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，但是目前關(guān)于肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的機(jī)制并不完全清楚，因此探索肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖發(fā)病機(jī)制非常有意義。過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPAR-γ)屬于

2、核受體家族，在細(xì)胞分化、發(fā)育、代謝、炎癥和腫瘤的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用。正常條件下，PPAR-γ廣泛表達(dá)于人類的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞，調(diào)控其增殖。以往的對(duì)于PPAR-γ多集中其調(diào)節(jié)血脂功能及減輕Ⅱ型糖尿病的病情的作用。近來有研究表明，PPAR-γ可能與肺動(dòng)脈高壓的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，但是具體機(jī)制不清。細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加被認(rèn)為是刺激肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的關(guān)鍵因子。細(xì)胞外瞬時(shí)受體電位通道家族是一類六次跨膜的非選擇性陽(yáng)離子通道，廣泛表達(dá)于

3、哺乳動(dòng)物體內(nèi)，參與許多重要生理學(xué)功能，如對(duì)溫覺、痛覺、聽覺的感知。瞬時(shí)受體電位鈣離子通道(TRPC)是TRP的一個(gè)亞組，在人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)豐富，近年來，研究表明TRPC1和TRPC6在低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓肺組織中呈高表達(dá)，但是在PPHN大鼠模型及低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中，TRPC1和TRPC6的是否起著關(guān)鍵作用及具體的發(fā)病機(jī)制是不清的。血紅素加氧酶1（HO-1）作為血紅素降解的限速酶，可以降解血紅素，生成膽綠素、CO和鐵離子

4、，而且CO已經(jīng)被證明有擴(kuò)張血管的作用和抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖的作用。有研究表明，在人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞核人的臍動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞中，激活PPAR-γ可以誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)，那么在PPHN大鼠模型及低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖中，PPAR-γ是否可以調(diào)節(jié)HO-1的表達(dá)是未知的。辛伐他汀(simvastatin，作為一種羥甲基戊二酰輔酶A(HMG-COA)還原酶抑制劑，抑制膽固醇的合成，起到降血脂的作用。大量研究表明，他汀類藥物具有抗炎和免疫

5、調(diào)節(jié)作用，可以減低心血管疾病的發(fā)病率和病死率。研究證實(shí)，辛伐他汀可以激活PPAR-γ進(jìn)而抑制血管緊張素誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞的炎癥和氧化應(yīng)激。也有研究表明，在伴隨缺血性心力衰竭的左心室肥厚的兔子模型中，辛伐他汀的治療可以激活PPAR-γ依賴的通路減弱左心室肥厚。但是辛伐他汀是否可以通過PPAR-γ/HO-1通路抑制低氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖是未知的。因此本研究，在建立PPHN大鼠模型的基礎(chǔ)上，結(jié)合細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，通過形態(tài)學(xué)、蛋白和基因

6、表達(dá)的測(cè)定，試圖證明PPAR-γ可以通過TRPC途徑或者HO-1/P21通路影響肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖，從而為PPHN的防治提供新的藥物和治療靶點(diǎn)。
　　方法：用低氧聯(lián)合吲哚美辛處理孕鼠建立PPHN大鼠模型，在懷孕第22天，麻醉孕鼠并迅速剖腹取出胎鼠，斷頭取血，離心后取血漿，用于Elisa監(jiān)測(cè)，分離肺組織及心臟，其右肺下頁(yè)用4％多聚甲醛固定后，石蠟包埋，用于蘇木素伊紅(HE)染色和免疫組化染色，左肺和剩余右肺置于液氮中，后保存于-

7、80℃冰箱，用于Real-time PCR和Western-blot檢測(cè)，分離右心室，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)，應(yīng)用HE染色和α-SMA免疫組化染色及免疫熒光染色觀察肺形態(tài)學(xué)及肺小動(dòng)脈重塑的指標(biāo)變化;分離左心室，計(jì)算右心室肥厚指數(shù)，Elisa方法監(jiān)測(cè)血漿腦鈉肽的含量間接反應(yīng)血流動(dòng)力學(xué)的改變，然后評(píng)價(jià)PPHN大鼠模型是否建立成功。應(yīng)用免疫組化染色方法、Western-blot和Real-time PCR方法檢測(cè)肺組織中PPAR-γ、 TRPC1

8、、TRPC6的蛋白和mRNA表達(dá)變化;Western-blot方法檢測(cè)肺組織中HO-1和P21蛋白表達(dá)變化。人原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞(HPASMC)被用于本次實(shí)驗(yàn)，分別給予低氧刺激及藥物處理研究PASMC增殖的發(fā)病機(jī)制。根據(jù)低氧或者藥物（羅格列酮、SKF96365、辛伐他?。┨幚韺⑵浞譃樗慕M:對(duì)照組，對(duì)照組加藥物處理組，低氧組，低氧加藥物處理組，分別應(yīng)用MTT方法及Western-blot檢測(cè)細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白PCNA、cyclinD1和P

9、21表達(dá)變化去觀察HPASMC的增殖的情況的變化，應(yīng)用免疫組化染色或者western-blot檢測(cè)相關(guān)通路，如PPAR-γ、TRPC1、TRPC6的蛋白表達(dá)變化或者PPAR-γ/HO-1/P21通路的蛋白表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Mean±SEM表示，應(yīng)用SPSS17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05提示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：⑴HE染色和α-SMA的免疫組化染色和免疫熒光

10、染色結(jié)果表明，模型組肺小動(dòng)脈血管壁增厚，血管腔狹窄，中層平滑肌增厚，肺小動(dòng)脈中膜面積百分比和中膜厚度百分比明顯增加；⑵血流動(dòng)力學(xué)分析結(jié)果顯示模型組血漿腦鈉肽含量明顯增加，右心室肥厚指數(shù)也明顯增加；⑶免疫組化、Western-blot和Real-timePCR結(jié)果表明，模型組肺組織中PPAR-γ的蛋白和基因水平均明顯減少；⑷Pearson相關(guān)性分析表明PPAR-γ蛋白表達(dá)和mRNA表達(dá)分別與肺小動(dòng)脈中膜面積百分比和厚度百分比成顯著負(fù)相關(guān)；

11、⑸免疫組化、Western-blot和Real-timePCR結(jié)果表明，模型組肺組織中TRPC1和TRPC6蛋白表達(dá)明顯升高，mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；⑹western-blot結(jié)果表明，模型組肺組織中的HO-1和P21蛋白表達(dá)明顯減少；⑺Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明:PPAR-γ蛋白表達(dá)量分別與TRPC1和TRPC6的蛋白表達(dá)量成顯著負(fù)相關(guān)，PPAR-γ蛋白表達(dá)量與HO-1蛋白表達(dá)量成顯著正相關(guān)；⑻慢性低氧促進(jìn)HPASMC的增

12、殖；⑼MTT的檢測(cè)結(jié)果表明，低氧促進(jìn)HPASMC的增殖，羅格列酮處理后，減弱了低氧條件下HPASMC的增殖；⑽Western-blot結(jié)果表明，與正常氧濃度的對(duì)照組相比，低氧組HPASMC中增殖相關(guān)蛋白PCNA和cyclinD1顯著增加，P21蛋白顯著減少，羅格列酮處理后減弱了低氧條件下HPASMC中PCNA和cyclinD1蛋白表達(dá)，增加了P21的蛋白表達(dá)；⑾細(xì)胞免疫組織化學(xué)和Western-blot結(jié)果表明表明，與正常氧濃度對(duì)照組相

13、比，低氧組HPASMC中PPAR-γ蛋白顯著減少，TRPC1和TRPC6的蛋白顯著增加，羅格列酮處理后，低氧條件下的顯著增加了低氧條件下PPAR-γ蛋白表達(dá)，顯著減弱低氧條件的TRPC1和TRPC6蛋白的增加；⑿MTT的檢測(cè)結(jié)果表明，低氧促進(jìn)HPASMC的增殖，SKF96365處理后，顯著減弱了低氧條件下HPASMC的增殖；⒀Western-blot結(jié)果表明，與正常氧濃度的對(duì)照組相比，低氧組HPASMC中增殖相關(guān)蛋白PCNA和cycli

14、nD1顯著增加，P21蛋白顯著減少，SKF96365處理后減弱了低氧條件下HPASMC中PCNA和cyclinD1蛋白表達(dá)，增加了P21的蛋白表達(dá)；⒁Western-blot結(jié)果表明，與正常氧濃度的對(duì)照組相比，低氧組HPASMC中TRPC1和TRPC6蛋白表達(dá)明顯增加，SKF96365處理后，顯著減弱了低氧條件下HPASMC中的TRPC1和TRPC6蛋白表達(dá)；⒂MTT結(jié)果表明，低氧顯著增加了HPASMC的增殖，辛伐他汀處理后顯著減弱了低

15、氧誘導(dǎo)的HPASMC的增殖；⒃Western-blot結(jié)果表明，與正常氧濃度對(duì)照組相比，低氧組HPASMC中PPAR-γ、HO-1和P21蛋白表達(dá)顯著下降，辛伐他汀處理后，顯著增加了低氧條件下HPASMC中PPAR-γ、HO-1和P21蛋白表達(dá)。
　　結(jié)論：①SKF96365通過改變TRPC1和TRPC6蛋白減弱低氧誘導(dǎo)的HPASMC的增殖；②羅格列酮激活PPAR-γ，可以部分下調(diào)TRPC1和TRPC6的蛋白表達(dá)或者部分上調(diào)HO-