14,15-EET通過(guò)調(diào)控中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和功能促進(jìn)機(jī)體轉(zhuǎn)移休眠潛伏病灶的發(fā)展.pdf

1、目的：腫瘤休眠是腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵。當(dāng)微環(huán)境變成適應(yīng)腫瘤生長(zhǎng)的狀態(tài)時(shí)，腫瘤的休眠狀態(tài)可以被逆轉(zhuǎn)。然而，花生四烯酸的代謝產(chǎn)物表氧化二十碳三烯酸之一14,15-EET可以促進(jìn)休眠病灶的發(fā)展；因此，本文旨在探討14,15-EET是否可以作為一種生理因子調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)微小休眠病灶的再生長(zhǎng)，以及14,15-EET調(diào)控微環(huán)境促進(jìn)微小休眠病灶發(fā)展的具體機(jī)制。
　　方法：⑴用TGF-β1/H2O2/HOCl(T/H/H)-刺激以后的非

2、轉(zhuǎn)移性腫瘤細(xì)胞尾靜脈接種三周以后建立微小休眠轉(zhuǎn)移模型，再尾靜脈給藥14,15-EET到第6周后通過(guò)觀察肺表明的宏觀結(jié)節(jié)以及 H&E染色評(píng)價(jià)14,15-EET是否可以促進(jìn)微小休眠病灶的發(fā)展。⑵用軟瓊脂集落形成實(shí)驗(yàn)來(lái)檢測(cè)14,15-EET處理以后腫瘤細(xì)胞增殖的情況，用Real-time PCR檢測(cè)體內(nèi)體外14,15-EET刺激腫瘤細(xì)胞后血管相關(guān)基因Vegfa/VEGFA、Mmp9/MMP9的表達(dá)，用免疫熒光觀察腫瘤病灶中血管生成的情況。用M

3、MP9KO小鼠進(jìn)一步確定MMP-9是來(lái)自非腫瘤細(xì)胞的。⑶用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)14,15-EET處理以后轉(zhuǎn)移模型中腫瘤結(jié)節(jié)周圍中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)情況。用Real-time PCR檢測(cè)14,15-EET處理后肺組織中性粒細(xì)胞相關(guān)基因 Itgam（CD11b）、Ly6g（Ly6G）的表達(dá)。用單克隆抗體清除中性粒細(xì)胞后判斷14,15-EET是否還能促進(jìn)微小潛伏病灶的發(fā)展。⑷檢測(cè)14,15-EET促進(jìn)病灶處中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)的機(jī)制。用Real-tim

4、e PCR檢測(cè)14,15-EET刺激腫瘤細(xì)胞后中性粒細(xì)胞趨化因子相關(guān)基因 Cxcl1（CXCL1）、Cxcl2（CXCL2）、Cxcl5（CXCL5）、Cxcl15（CXCL8）、Ccl2（CCL2）、Ccl3（CCL3）、Ccl4（CCL4） Ccl5（CCL5）、GM-CSF（csf2）的表達(dá)情況。用 IL-8 shRNA抑制 IL-8的上調(diào)后判斷其對(duì) PMN的趨化作用。ELISA檢測(cè)14,15-EET處理腫瘤細(xì)胞以后 IL-8的表

5、達(dá)。Western bloting檢測(cè)14,15-EET激活腫瘤細(xì)胞相關(guān)信號(hào)途徑水平。⑸檢測(cè)14,15-EET促進(jìn)IL-8分泌相關(guān)miRNAs的表達(dá)情況及其機(jī)制。Real-time PCR檢測(cè)14,15-EET刺激后所有與 IL-8翻譯和分泌相關(guān) miRNAs的表達(dá)。Western bloting檢測(cè)14,15-EET刺激后miR-155靶蛋白DET1、SHIP-1的變化。用miR-155 inhibitor判斷其對(duì)IL-8表達(dá)和分泌的

6、影響。⑹免疫組化檢測(cè)腫瘤細(xì)胞單純轉(zhuǎn)染pIL-8后尾靜脈接種到小鼠體內(nèi)對(duì)中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)和對(duì)微小潛伏病灶的影響。⑺檢測(cè)14,15-EET改變中性粒細(xì)胞功能的作用效果。分離14,15-EET處理后小鼠的骨髓中性粒細(xì)胞和腹腔中性粒細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞混合接種，根據(jù)瘤重評(píng)價(jià)中性粒細(xì)胞的促瘤效果。用 Real-time PCR檢測(cè)14,15-EET刺激中性粒細(xì)胞后 Trail、Mmp9基因的變化。用明膠酶譜檢測(cè)14,15-EET刺激中性粒細(xì)胞后活性MM

7、P9的表達(dá)。用Western bloting檢測(cè)14,15-EET刺激中性粒細(xì)胞后STAT3、TRAIL的表達(dá)。ELISA檢測(cè)14,15-EET處理小鼠后血清 IL-6和 G-CSF的變化。
　　結(jié)果：①非侵襲性腫瘤細(xì)胞、T/H/H-非侵襲腫瘤細(xì)胞、非侵襲性腫瘤接種+14,15-EET尾靜脈注射組6周后都沒(méi)有大的轉(zhuǎn)移病灶形成和肉眼可見(jiàn)結(jié)節(jié)，只有 T/H/H-非侵襲性腫瘤細(xì)胞接種+3周后14,15-EET尾靜脈注射組6周后，肺組織表

8、明可見(jiàn)結(jié)節(jié)和H&E染色后可見(jiàn)大的轉(zhuǎn)移病灶。②14,15-EET刺激組，軟瓊脂集落變大且數(shù)量也多于非刺激組。14,15-EET體內(nèi)體外刺激均不能上調(diào)腫瘤細(xì)胞 Vegfa/VEGFA的表達(dá)，但是尾靜脈注射14,15-EET組的肺組織Mmp-9表達(dá)上調(diào)，體外刺激腫瘤細(xì)胞卻沒(méi)有達(dá)到相應(yīng)的上調(diào)水平。在尾靜脈接種的MMP9KO小鼠即使尾靜脈注射14,15-EET，腫瘤病灶也只能有限的增大并不能形成肉眼可見(jiàn)的結(jié)節(jié)和大的轉(zhuǎn)移病灶。免疫熒光結(jié)果顯示在 W

9、T小鼠接種和尾靜脈注射14,15-EET組病灶處可見(jiàn)明顯的新生血管，但是在MMP9KO小鼠和其他組均未見(jiàn)血管。③Control、14,15-EET、T/H/H刺激組免疫組化和Real-time PCR結(jié)果均顯示沒(méi)有PMN浸潤(rùn)，只有T/H/H刺激組+14,15-EET組可見(jiàn)中④（4） Real-time結(jié)果顯示在所有中性粒細(xì)胞趨化因子中，14,15-EET主要上調(diào)Il8，ELISA結(jié)果也表明14,15-EET上調(diào)IL-8的表達(dá)。IL-8

10、shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞以后，14,15-EET不能引起中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。Western bloting結(jié)果表明14,15-EET主要激活 STAT3、JNK這兩條信號(hào)通路。⑤14,15-EET可以上調(diào) miR-155的上調(diào)，不能上調(diào)其他miRNAs的表達(dá)。Western bloting結(jié)果顯示14,15-EET刺激后腫瘤細(xì)胞中DET1和SHIP-1均下調(diào)。加入miR155 inhibitor后，14,15-EET上調(diào)IL-8的作用減弱。⑥p

11、IL-8轉(zhuǎn)染非侵襲性腫瘤細(xì)胞以后，尾靜脈接種6周后并未見(jiàn)有結(jié)節(jié)和病灶，但肺組織中有中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)。⑦14,15-EET處理后的小鼠骨髓中性粒細(xì)胞和腹腔中性粒細(xì)胞均有促瘤生長(zhǎng)的作用，并且血清IL-6和G-CSF均上調(diào)。14,15-EET刺激中性粒細(xì)胞后STAT3被激活，sTRAIL下調(diào)，MMP-9上調(diào)。
　　結(jié)論：14,15-EET可以促進(jìn)體內(nèi)微小休眠潛伏病灶的發(fā)展。其主要機(jī)制是通過(guò)激活腫瘤細(xì)胞內(nèi)miR-155和JNK/STAT3