周期性動(dòng)態(tài)壓縮應(yīng)力對條件性敲除Ihh基因軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)力學(xué)—生物學(xué)特性的分析.pdf

1、目的：
　　利用Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl基因工程小鼠所培育的未成熟的小鼠的肋軟骨細(xì)胞，使用周期性動(dòng)態(tài)壓縮應(yīng)力（Flexcell-5000施加正弦波、0.5Hz、5kPa、1h/d壓縮應(yīng)力）的方法探討條件性敲除Ihh基因后的軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)的力學(xué)生物學(xué)特性。
　　方法：
　　1.基因工程小鼠（Col2a1-CreERT2;Ihhfl/fl和Ihhfl/fl）的培育及其基因鑒定。
　　2.取剛出

2、生的基因工程小鼠（攜帶Ihhfl/fl純合基因并且具有Col2a1-CreERT2基因）40只。隨機(jī)的分為實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組基因小鼠給予腹腔連續(xù)注射3天 TM（Tamoxifen），對照組基因小鼠給予腹腔連續(xù)注射3天等量植物油，待第6天時(shí)取小鼠肋軟骨，急性消化肋軟骨細(xì)胞作為本實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞來源。
　　3.用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)來檢測 Ihh基因相對表達(dá)量，計(jì)算 Ihh基因的敲除率。
　　4.將實(shí)驗(yàn)組與對照組急性消化分離的細(xì)

3、胞以2×105/ml的密度混于1.5％的海藻酸鈉凝膠中，利用模型制成海藻酸鈉細(xì)胞盤。實(shí)驗(yàn)組與對照組各自分為兩組：其中一組海藻酸鈉細(xì)胞盤用 Flexcell-5000基底加載系統(tǒng)施加動(dòng)態(tài)壓縮應(yīng)力(正弦波、0.5Hz、5kPa、1h/d)7、14、21天；另一組海藻酸鈉細(xì)胞盤靜態(tài)培養(yǎng)7、14、21天。
　　5.分別在7、14、21天時(shí)在倒置顯微鏡下觀察各組軟骨細(xì)胞的生長狀況。
　　6.通過RT-PCR技術(shù)測定同一時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)組和

4、對照組內(nèi)細(xì)胞盤的Ⅱ型膠原、Ⅹ型膠原、蛋白多糖（AGG）、基質(zhì)金屬蛋白酶13（MMP-13）mRNA的相對表達(dá)量。
　　7.運(yùn)用半無限體細(xì)胞力學(xué)模型與微管吸吮技術(shù)相結(jié)合來測定各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞力學(xué)特性。
　　結(jié)果：
　　1.通過RT-PCR檢測Ihh基因相對表達(dá)量發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組基因小鼠在腹腔注射TM（Tamoxifen）后與對照組相比其Ihh基因相對表達(dá)量降低（P<0.01）。對Ihh信號通路的下游基因Gli-1的相對

5、表達(dá)量進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組Gli-1基因表達(dá)降低（P<0.01）（圖1）。敲除效率約為64%。
　　2.同一時(shí)間點(diǎn)，壓縮刺激可以促進(jìn)軟骨細(xì)胞在海藻酸鈉凝膠中的增殖，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞盤發(fā)現(xiàn)：實(shí)驗(yàn)組、對照組內(nèi)壓縮細(xì)胞盤的細(xì)胞密度隨著壓縮刺激天數(shù)的增長而增加，其密度明顯高于同組內(nèi)靜態(tài)培養(yǎng)組；實(shí)驗(yàn)組(基因敲除)與對照組(未敲除)相比：敲除Ihh后的軟骨細(xì)胞盤與未敲除Ihh的軟骨細(xì)胞盤中的細(xì)胞密度相差不明顯。
　　3.RT-PCR檢

6、測：（1）實(shí)驗(yàn)組(基因敲除)與對照組(未敲除)立體培養(yǎng)細(xì)胞盤相比、壓縮細(xì)胞盤相比：7天時(shí),實(shí)驗(yàn)組的AGG、Col II相對表達(dá)量增高(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組內(nèi)、對照組內(nèi)的壓縮細(xì)胞盤與立體培養(yǎng)細(xì)胞盤相比：壓縮7天AGG、Col II相對表達(dá)量增高(P<0.05)；各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)AGG、Col II相對表達(dá)量對比：壓縮組7天表達(dá)量高于14天、21天(P<0.05)；（2）實(shí)驗(yàn)組(基因敲除)與對照組(未敲除)中立體培養(yǎng)細(xì)胞盤相比、壓縮細(xì)胞盤

7、相比：實(shí)驗(yàn)組的內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)ColⅩ、MMP-13的相對表達(dá)量較對照組內(nèi)各時(shí)間點(diǎn)的相對表達(dá)量均降低，其中7天、21天實(shí)驗(yàn)組的表達(dá)水平降低明顯(P<0.05)；實(shí)驗(yàn)組內(nèi)、對照組內(nèi)的壓縮細(xì)胞盤與立體培養(yǎng)細(xì)胞盤相比：壓縮14天時(shí)ColⅩ、MMP-13的相對表達(dá)量增高(P<0.05)；各組內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)對比：壓縮組14天ColⅩ、MMP-13的相對表達(dá)量高于7天、21天(P<0.05)。
　　4.各組內(nèi)細(xì)胞瞬時(shí)模量（E0）、平衡模量（E∞）、表

8、觀黏性（μ）隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而降低，其中實(shí)驗(yàn)組、對照組內(nèi)壓縮21天的E0、E∞、μ明顯低于同組內(nèi)壓縮7、14天（P＜0.05），7天與14天之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；實(shí)驗(yàn)組與對照組相比較，在同一時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組立體培養(yǎng)軟骨細(xì)胞、動(dòng)態(tài)壓縮的軟骨細(xì)胞的E0、E∞、μ均大于對照組，其中實(shí)驗(yàn)組內(nèi)壓縮21天的E0、E∞明顯高于對照組內(nèi)壓縮21天（P＜0.05）；實(shí)驗(yàn)組內(nèi)與對照組內(nèi)同一時(shí)間點(diǎn)的動(dòng)態(tài)壓縮軟骨細(xì)胞的E0、E∞、μ均大于立體培養(yǎng)軟骨細(xì)胞的E0、E∞