橄欖樹內(nèi)生菌分離及其耐有機(jī)溶劑脂肪酶研究.pdf

1、脂肪酶是一類酯鍵水解酶。它除了催化油脂水解反應(yīng)外,還可催化酯化反應(yīng)、轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)、酯的酸解、酯的醇解和酯的氨解等多種類型的反應(yīng)。在催化過(guò)程中,脂肪酶表現(xiàn)底物特異性、化學(xué)選擇性、區(qū)域選擇性和對(duì)映體選擇性等特性,已被廣泛應(yīng)用于精細(xì)化工、洗滌、醫(yī)藥、食品、造紙、皮革加工、紡織、飼料和生物柴油等領(lǐng)域,成為最有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的生物催化劑之一。在實(shí)際應(yīng)用和不同的工業(yè)生產(chǎn)過(guò)程中,對(duì)脂肪酶分子穩(wěn)定性、底物選擇性和催化活性等要求各不相同,需要眾多不同類型的脂肪酶

2、提供選擇。因此,不同來(lái)源脂肪酶產(chǎn)生菌分離及其合成的不同類型酶分子研究始終是研究熱點(diǎn)之一。
　　 本文基于微生物生態(tài)學(xué)分離策略,選擇分離油脂和有機(jī)物質(zhì)含量較為豐富的橄欖樹內(nèi)生、共生和附生微生物。共分離到118個(gè)脂肪酶產(chǎn)生菌株,其中75株細(xì)菌,25株酵母菌和18株霉菌。分離菌株中分別有9株細(xì)菌,4株酵母菌和5株霉菌產(chǎn)生的脂肪酶不僅具有水解能力,還具有耐有機(jī)溶劑和催化酯合成能力。其中細(xì)菌菌株B18和B22產(chǎn)生的脂肪酶粗酶液酶活較高,并

3、具有較高的有機(jī)溶劑耐受能力。經(jīng)16srDNA鑒定分別為腸桿菌屬和檸檬酸桿菌屬,這兩個(gè)屬均為常見的內(nèi)生菌。兩個(gè)菌株編號(hào)分別為Entrobacteria sp.FN301和Citrobacter sp.FN302。
　　 蛋白質(zhì)純化是進(jìn)一步研究純酶性質(zhì)的前提。Citrobacter sp.FN302菌株發(fā)酵液通過(guò)超濾濃縮、DEAE Sepharose Fast Flow離子交換層析和Sephacryl S-100凝膠層析后,得到了電

4、泳純的脂肪酶CFL302。SDS-PAGE電泳估算其表觀分子量約為40KDa。對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn):CFL302是一種耐熱、耐有機(jī)溶劑脂肪酶。最適作用溫度在45℃,40℃～60℃內(nèi)有較好的催化活性;35℃～65℃該酶的穩(wěn)定性較好；最適作用pH約為7.0,且pH在4.0～9.0時(shí)較穩(wěn)定；對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性較好,在丙酮、正庚烷、正己烷、異辛烷、苯和二甲苯中酶活均比純水相有所提高；10mmol/L的Ca2+和Mg2+對(duì)CFL302的酶活力有促

5、進(jìn)作用,其中Ca2+促進(jìn)作用最大；Tween20、Tween80和Urea對(duì)酶活力具有提高的作用；CFL302對(duì)C鏈長(zhǎng)度小于或等于12的短鏈脂肪酸形成的甘油三酯具有較強(qiáng)的水解能力。本文還對(duì)CFL302酶蛋白質(zhì)進(jìn)行N端測(cè)序,獲得其N端12個(gè)氨基酸序列為:N-I-S-C-C-C-R-E-K-P-G-I,與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中蛋白序列比對(duì)未找到與之同源的脂肪酶基因序列,該脂肪酶來(lái)源、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)較為特殊,很可能是一種新的脂肪酶,具有進(jìn)一步研究?jī)r(jià)值。

6、
　　 為了獲得更大量的純酶,培養(yǎng)基優(yōu)化是一條重要途徑。本文通過(guò)單因素試驗(yàn)結(jié)合響應(yīng)面設(shè)計(jì)分析,確定Citrobacter sp.FN302菌株優(yōu)化后的產(chǎn)酶培養(yǎng)基為:麥芽糖0.93％、酵母膏1.8％、橄欖油乳化液2.9％、硫酸鎂0.12％,磷酸氫二鉀0.12％,初始pH值7.5、接種量5％,30℃培養(yǎng),轉(zhuǎn)速230 rpm,發(fā)酵24h。優(yōu)化后Citrobactersp.FN302菌株發(fā)酵液酶活從1.5U/ml提高至6.2U/ml,提