小麥TaZAT8與TaWRKY2基因特征及抵御低磷等營養(yǎng)逆境功能.pdf

1、鋅指轉(zhuǎn)錄因子通過調(diào)控下游基因的表達(dá)在植株應(yīng)答非生物和營養(yǎng)逆境過程中扮演著重要角色。本研究鑒定了一個(gè)小麥C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因TaZAT8和一個(gè)小麥WRKY型鋅指轉(zhuǎn)錄因子基因TaWRKY2。TaZAT8具有C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子的典型特征，包含兩個(gè)C2H2鋅指域和QALGGH保守區(qū)。不同低磷濃度脅迫下，小麥根中TaZAT8的表達(dá)水平均上調(diào)，在20μM時(shí)的表達(dá)水平較高。以20μM濃度處理，TaZAT8轉(zhuǎn)錄水平在脅迫1h后明顯增加，48h

2、內(nèi)保持較高水平，恢復(fù)正常培養(yǎng)48h后，表達(dá)水平又下降。結(jié)合皿培和土培實(shí)驗(yàn)研究超表達(dá)TaZAT8的煙草轉(zhuǎn)基因系OE3和OE5植株低磷下的應(yīng)答，發(fā)現(xiàn)低磷處理后，與野生型相比轉(zhuǎn)基因系表現(xiàn)出植株增大、根系增加和生物量增多等表型特征。進(jìn)一步研究表明，磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白NtPT1和NtPT2及與生長素極性運(yùn)輸及調(diào)節(jié)根發(fā)生伸長的相關(guān)基因NtPIN1和NtPIN4在轉(zhuǎn)基因系植株根系中呈上調(diào)表達(dá)與低磷逆境下的根系表型變化一致。而低磷脅迫下轉(zhuǎn)基因系較野生型植株中S

3、OD、POD、CAT保護(hù)酶活性增強(qiáng)，MDA含量降低，同時(shí)對一系列上述保護(hù)酶基因的表達(dá)分析表明，低磷脅迫下部分成員在轉(zhuǎn)基因植株中表達(dá)量增加。通過DAB法和NBT法分別對H2O2和O2-·進(jìn)行了組織定位定量檢測表明，低磷脅迫下OE3和OE5的葉片染色程度相對較淺。上述結(jié)果可能與轉(zhuǎn)基因植株低磷逆境下抵御能力增強(qiáng)，生長狀態(tài)較好有關(guān)。
　　應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)對超表達(dá)TaZAT8的煙草進(jìn)行蛋白質(zhì)差異表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，有22個(gè)蛋白的表達(dá)量發(fā)生了變化

4、，經(jīng)LC-MS/MS質(zhì)譜鑒定，差異蛋白涉及逆境應(yīng)答及細(xì)胞保護(hù)、物質(zhì)代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄翻譯、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換和未知功能6個(gè)類別。結(jié)合一些蛋白的功能分析，表明過表達(dá)TaZAT8基因帶來了一系列變化，為植株面對可能出現(xiàn)的低磷等非生物逆境做了準(zhǔn)備。
　　TaWRKY2為典型的WRKY型鋅指轉(zhuǎn)錄因子，包含兩個(gè)WRKY域和兩個(gè)C2H2鋅指域。進(jìn)化分析表明TaWRKY2與同種屬的TaWRKY25序列一致性最高。高鹽和干旱非生物逆境及低磷、低氮、低鉀

5、、低鈣和低鋅營養(yǎng)脅迫下，TaWRKY2基因在小麥根中均呈上調(diào)表達(dá)，表達(dá)模式略有不同，表明該TaWRKY2參與多個(gè)脅迫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。利用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了融合TaWRKY2正、反義序列及該基因與GFP融合的雙元表達(dá)載體重組質(zhì)粒，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法建立了該基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。
　　在正常培養(yǎng)和不同營養(yǎng)逆境條件下，以瓊脂、霍格蘭營養(yǎng)液和蛭石為培養(yǎng)載體，對野生型和超表達(dá)TaWRKY2轉(zhuǎn)基因系植株進(jìn)行表型鑒定。在瓊脂皿培時(shí)，目前發(fā)現(xiàn)低磷

6、處理下轉(zhuǎn)基因系植株比野生型植株增大，其他處理?xiàng)l件下表型無明顯差異。而水培和土培結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在低磷和低鈣逆境下，轉(zhuǎn)基因系在這兩種培養(yǎng)條件下植株大小均優(yōu)于野生型植株。進(jìn)一步研究表明，與TaZAT8相似，低磷脅迫下磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因NtPT1和NtPT2在過表達(dá)TaWRKY2的轉(zhuǎn)基因植株根系中也上調(diào)表達(dá)。低鈣處理下，超表達(dá)TaWRKY2提高了兩個(gè)鈣通道蛋白基因CCP5和CCP3和多個(gè)保護(hù)酶基因的表達(dá)量，此外3個(gè)PIN基因NtPIN1b、NtPIN4