小麥TaHKT8基因克隆、結(jié)構(gòu)分析及功能驗(yàn)證.pdf

1、HKT（high-affinity K+transporter）類蛋白具有排鈉吸鉀功能，在植物耐鹽中具有重要作用。本研究從基因克隆、生物信息學(xué)分析及真核生物表達(dá)對(duì)小麥TaHKT8進(jìn)行了不同層次的研究。其主要結(jié)果如下： 1．TaHKT8基因的克隆。根據(jù)NCBI網(wǎng)站上已經(jīng)公布的小麥TaHKT8基因序列設(shè)計(jì)引物，經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增，得到了1600bp的條帶，測(cè)序結(jié)果與公布的序列一致。 2．TaHKT8結(jié)構(gòu)分析。利用多種生物信息

2、學(xué)技術(shù)對(duì)小麥TaHKT8核苷酸及氨基酸序列特征進(jìn)行了分析。TaHKT8基因mRNA中196～1590bp為單一外顯子區(qū)域，即開放閱讀框（ORF），但多聚A信號(hào)并不明顯。其蛋白的分子式為C2618H4096N6780712S26，相對(duì)分子量為57．3kD，等電點(diǎn)為8．90，理論推導(dǎo)半衰期小于30h，不穩(wěn)定參數(shù)29．75，屬于穩(wěn)定蛋白。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析表明，TaHKT8是由42．05％α-螺旋、18．80％延伸鏈、5．81％β-轉(zhuǎn)角和33．

3、33％無規(guī)則卷曲所組成，α-螺旋和無規(guī)則卷曲是TaHKT8中大量的結(jié)構(gòu)元件，而β-轉(zhuǎn)角和延伸鏈散布于整個(gè)蛋白質(zhì)中。TaHKT8包含10個(gè)跨膜區(qū)域，其N端在膜外，C端在膜內(nèi)，在膜外有175個(gè)氨基酸殘基，占33．9％，膜內(nèi)的氨基酸序列共有341個(gè)，占66．1％。同源比較分析結(jié)果表明，TaHKT8基因與其它植物HKT類基因高度同源，且與具有耐鹽功能的OsHKT8（水稻）、TaHKT7（小麥）和OsHKT7（水稻）關(guān)系較近。結(jié)構(gòu)功能域分析表明，

4、TaHKT8蛋白含有TrkH（Kation Transporter）功能域，該功能域具有陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)功能，是陽離子轉(zhuǎn)運(yùn)器，主要功能是鉀離子轉(zhuǎn)運(yùn)，具有該結(jié)構(gòu)域的蛋白還可以消耗ATP用來轉(zhuǎn)運(yùn)鈉離子，以維持細(xì)胞質(zhì)較高的K+/Na+比率，減少細(xì)胞質(zhì)中因過多的Na+對(duì)細(xì)胞造成的傷害。 3．TaHKT8耐鹽功能的驗(yàn)證。利用真核生物蛋白表達(dá)技術(shù)驗(yàn)證了TaHKT8耐鹽功能。構(gòu)建了TaHKT8基因的酵母表達(dá)載體TaHKT8-pYES2，通過PEG熱

5、激將TaHKT8-pYES2轉(zhuǎn)化酵母AXT3K細(xì)胞。經(jīng)YNB+A+T培養(yǎng)基篩選，得到轉(zhuǎn)TaHKT8-pYES2酵母。轉(zhuǎn)基因酵母的DNA經(jīng)過PCR、酶切及測(cè)序等不同方法鑒定表明，TaHKT8基因已整合到酵母細(xì)胞基因組中。在30～40mM NaCl的AP培養(yǎng)基上，未轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞（WT）的生長(zhǎng)明顯受阻，轉(zhuǎn)基因酵母則生長(zhǎng)正常。說明TaHKT8表達(dá)產(chǎn)物賦予酵母細(xì)胞有較強(qiáng)的耐鹽能力。用不同濃度的KC1處理，則轉(zhuǎn)基因和對(duì)照（WT）沒有明顯的差別：K