微生物細(xì)胞非水相催化羰基化合物的不對(duì)稱還原.pdf

1、在許多領(lǐng)域中，尤其是在藥物工業(yè)領(lǐng)域，獲得單一對(duì)映體純的手性化合物是非常必要的。具有光學(xué)活性的鹵代β-羥基酯和1-苯乙醇衍生物是合成多種手性藥物和其他生物活性化合物的重要砌塊。結(jié)合非水相生物催化的優(yōu)勢(shì)利用微生物細(xì)胞催化不對(duì)稱還原羰基化合物可以有效地制備這些手性醇。 建立了用氣相色譜法測(cè)定手性醇對(duì)映體純度的方法。用β-環(huán)糊精(β-CD)手性固定相在氣相色譜上分離了乙?；?-氯-3-羥基丁酸乙酯，考察了色譜條件對(duì)分離的影響。然后拆分

2、了各種外消旋醇，測(cè)定并計(jì)算熱力學(xué)數(shù)據(jù)。結(jié)果表明，載氣流速、柱溫、程序升溫速率、起始溫度維持時(shí)間和進(jìn)樣量對(duì)對(duì)映體在β-CD上的分離有明顯影響；芳基醇無(wú)需衍生化普遍能得到較好的分離，β-CD固定相對(duì)芳基醇的手性識(shí)別明顯要優(yōu)于直鏈羥基酸酯。通過(guò)熱力學(xué)數(shù)據(jù)的分析認(rèn)為，色譜分離過(guò)程中存在焓-熵補(bǔ)償，這些化合物在β-CD固定相上的拆分機(jī)理是基本一致的。 考察了有機(jī)溶劑對(duì)微生物細(xì)胞的毒性。不同有機(jī)溶劑對(duì)出芽短梗霉GCMCC1244細(xì)胞的毒性各

3、異，毒性大小與疏水性參數(shù)logP存在相關(guān)性，logP從3到5是有機(jī)溶劑對(duì)出芽短梗霉細(xì)胞有毒到無(wú)毒的過(guò)渡區(qū)；海藻酸鈣細(xì)胞固定化可以減少有機(jī)溶劑對(duì)其的毒害作用；不同生長(zhǎng)階段的微生物細(xì)胞對(duì)有機(jī)溶劑的毒性反應(yīng)不同，快速生長(zhǎng)期(12h)的細(xì)胞較敏感。同一有機(jī)溶劑對(duì)枯草芽孢桿菌的毒性比出芽短梗霉和酵母要小，后兩種微生物的毒性反應(yīng)相近。 在水/有機(jī)溶劑兩相體系中用出芽短梗霉GCMCC1244細(xì)胞催化4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)制備(S)-4

4、-氯-3-羥基丁酸乙酯(CHBE)。CHBE在水溶液中比較穩(wěn)定，而COBE容易被分解；兩者對(duì)微生物細(xì)胞都有毒害作用，其中COBE的毒性要大于CHBE；鄰苯二甲酸二丁酯是組成水/有機(jī)溶劑兩相體系的最適有機(jī)相，在兩相體系中可獲得較高的摩爾轉(zhuǎn)化率、光學(xué)純度和產(chǎn)物在有機(jī)相中的濃度。通過(guò)考察各種影響因素如相體積比、振搖速度、生物量/底物量比、溫度以及pH發(fā)現(xiàn)，這些因素對(duì)反應(yīng)的摩爾轉(zhuǎn)化率和反應(yīng)初速度有明顯影響，但對(duì)產(chǎn)物的光學(xué)純度的影響很小。經(jīng)過(guò)條件

5、優(yōu)化后，有機(jī)相產(chǎn)物濃度可以達(dá)到58.2g/L，總摩爾轉(zhuǎn)化率可以達(dá)到93.2％，光學(xué)純度大于97％e.e.；固定化細(xì)胞反復(fù)利用不理想，COBE還原酶活力的損失并不是最主要的原因，而主要是因?yàn)楣潭ɑ?xì)胞經(jīng)過(guò)反應(yīng)后脫氫酶活力和還原酶的輔酶濃度大幅下降的緣故，影響了輔酶再生。 篩選得到一株能高立體選擇地催化還原TFAAE的菌株SaccharoinycesuvarumSW58，在水/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系中可以得到較好的結(jié)果，優(yōu)化條件下

6、，摩爾轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物的光學(xué)純度分別可達(dá)85.1％和85.4％e.e.；添加合適的共底物、丙稀基溴處理細(xì)胞和用凍干細(xì)胞可以改善反應(yīng)的立體選擇性，細(xì)胞熱處理對(duì)反應(yīng)不利。 用4種微生物分別在水相體系和水/有機(jī)溶劑兩相體系催化還原了10種苯烷酮化合物。假絲酵母SW0401表現(xiàn)出很強(qiáng)的還原活力，10個(gè)底物被還原均有相應(yīng)的產(chǎn)物醇生成，但立體選擇性不高，釀酒酵母SW57對(duì)苯烷酮表現(xiàn)出普遍較高的立體選擇性，這兩種酵母催化苯乙酮還原反應(yīng)遵循了Pre

7、log規(guī)則。而在兩相體系中出芽短梗霉SW0202催化苯乙酮衍生物的不對(duì)稱還原反應(yīng)遵循反Prelog規(guī)則。朱紅密孔菌CGMCC1115的還原能力很低，僅能還原5種苯烷酮。苯烷酮苯環(huán)上取代基的電負(fù)性和結(jié)構(gòu)能影響還原反應(yīng)難易程度，取代基電負(fù)性強(qiáng)的容易被還原，取代基疏水性大不利于被還原；在水/鄰苯二甲酸二丁酯兩相體系中考察了釀酒酵母SW57催化還原2-氯苯乙酮，乙醇是較理想的輔助底物，其水相濃度以30g/L為宜。還原反應(yīng)的最適pH、溫度和機(jī)相初