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文檔簡(jiǎn)介
1、研究背景與目的:
由世界衛(wèi)生組織(WHO)規(guī)定的,夫婦生活1年以上并且不采用任何的避孕措施,由于男方因素而造成女方發(fā)生不孕者,稱(chēng)為男性不育。男性不育癥給人們的生活帶來(lái)了很大的痛苦,給個(gè)人及社會(huì)造成了一定的負(fù)擔(dān)。在世界上大約15%生育力低下的育齡夫婦中,由男性因素導(dǎo)致的不育占50%。而男性不育癥主要表現(xiàn)在生精障礙方面。已經(jīng)明確的與男性不育有明顯相關(guān)的因素有很多,其中包括精索靜脈曲張、梗阻、生殖系統(tǒng)感染、內(nèi)分泌或免疫性疾病、環(huán)
2、境毒物等,而涉及的遺傳因素眾多并且也非常重要。近年來(lái)經(jīng)大量研究發(fā)現(xiàn),染色體異常、Y染色體微缺失及相關(guān)基因的突變與男性生精障礙有關(guān)。
1976年,Tiepol等發(fā)現(xiàn)6例無(wú)精子患者在Y染色體長(zhǎng)臂遠(yuǎn)端發(fā)生了微缺失,并推測(cè)該區(qū)域應(yīng)該存在控制精子發(fā)生的相關(guān)基因,故把此區(qū)域成為AZF。后來(lái)又先后有科學(xué)家對(duì)該區(qū)域研究進(jìn)而推測(cè)AZF區(qū)微缺失與精子發(fā)生障礙有重要關(guān)系。
L.Lazaros等人于2008年對(duì)希臘人群研究發(fā)現(xiàn)雄激素
3、受體基因的(CAG)n和SHBG基因的(TAAAA)n的重復(fù)數(shù)的多少與精子的發(fā)生和精液的質(zhì)量有關(guān)。2010年Mohammad Reza Safarine ad等人對(duì)芬蘭人群進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)了男性不育的相關(guān)基因:SHBG(Sex hormone binding globulin,SHBG)基因與男性少弱精癥有關(guān)。另外,此基因rs6259(Asp327Asn)位點(diǎn)的突變導(dǎo)致增加了一個(gè)額外的糖鏈,從而引起SHBG的代謝清除率的減少,增加了S}IB
4、G的半衰期,并因此增加了SHBG的水平,通過(guò)改變雄激素和雌激素的利用度和行為,改變了雄激素和雌激素的生物活性,進(jìn)一步導(dǎo)致男性不育。Mei-Tsz等人對(duì)臺(tái)灣漢族人群雌激素相關(guān)基因進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)SHBG的rsl799941位點(diǎn)和rs6259位點(diǎn)與男性生精障礙有關(guān),是新發(fā)現(xiàn)的男性不育候選基因。本研究選取SHBG基因的兩個(gè)位點(diǎn)(rs6259,rs727428)進(jìn)行研究,以驗(yàn)證SHBG基因多態(tài)性是否與河南漢族人群男性不育相關(guān)。Rs6259位點(diǎn)有
5、研究發(fā)現(xiàn)與芬蘭人群和臺(tái)灣漢族人群男性不育有關(guān)但是還沒(méi)有對(duì)中國(guó)河南漢族人群男性不育的相關(guān)性研究,而rs727428位點(diǎn)在國(guó)內(nèi)外都沒(méi)有對(duì)其與男性不育相關(guān)性的研究。
本研究利用多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Mutiplex Polymemse chain reactionMutiplex PCR)先對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行了Y染色體微缺失的檢測(cè),再利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)一限制性片段多態(tài)性技術(shù)(Polymerase chain reaction rest
6、riction-fragmentlength polymorphism,PCR-RFLP)對(duì)河南漢族人群SHBG基因的rs6259位點(diǎn)和rs727428位點(diǎn)多態(tài)性進(jìn)行分析,研究其在河南漢族人群中的分布情況,及其與男性不育的相關(guān)性,從而為男性不育的臨床檢測(cè)與治療提供相關(guān)理論依據(jù)。
研究對(duì)象:
1.病例組
收集2011年3月-2011年8月來(lái)自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心及檢驗(yàn)科門(mén)診因不育來(lái)就診的2
7、08例患者,年齡在25-45歲(平均年齡32.4±6.4歲)?;颊呔鶕?jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行精液常規(guī)分析,并且排除睪丸炎、肝腎疾病、內(nèi)分泌疾病、染色體異常、生殖器疾病等病癥,經(jīng)確診為無(wú)精子或嚴(yán)重少精子病例作為研究對(duì)象。其中特發(fā)性無(wú)精癥48例,少精癥160例。精液常規(guī)檢查參考檢驗(yàn)科檢查結(jié)果,連續(xù)三次檢查確診為無(wú)精子癥、少精子癥(精子密度<20×106/ml)。
2.對(duì)照組
隨機(jī)選取健康且已經(jīng)生育過(guò)孩子
8、個(gè)體183例,年齡在25-45歲(平均年齡32.8±6.7歲)之間的作為正常對(duì)照組。
以上病例、對(duì)照兩組研究對(duì)象均是在其知情同意的原則下進(jìn)行,且均為河南地區(qū)漢族人,飲食結(jié)構(gòu)大致相似。
研究方法:
取研究對(duì)象被檢測(cè)精液1mL,用常規(guī)經(jīng)典的酚/氯仿法提取病例、對(duì)照組基因組DNA。設(shè)計(jì)、合成相應(yīng)引物,用PCR儀擴(kuò)增獲取目的片段,再經(jīng)HinfI限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行酶切,最后用3%及2%的瓊脂糖凝膠電泳分別對(duì)
9、多重PCR檢測(cè)基因缺失、普通PCR.及酶切檢測(cè)基因的多態(tài)性。用紫外分析凝膠成像儀進(jìn)行觀(guān)察照相并且記錄。
統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
所有得到數(shù)據(jù)處理均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件和SHEsis在線(xiàn)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,基因頻率使用數(shù)學(xué)計(jì)數(shù)法,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。男性不育組與正常對(duì)照組之間基因型頻率及等位基因頻率的差異采用x2檢驗(yàn),用Hardy-Weinberg(HWE)平衡檢驗(yàn)來(lái)估計(jì)群體所調(diào)查資料的可靠性,包括基因頻率估
10、計(jì)的準(zhǔn)確性和可靠性。HWE平衡及單倍體型分析均用SHEsis在線(xiàn)軟件(P>0.05)來(lái)檢測(cè)分析。計(jì)算比數(shù)比(Odds Ratio,OR)及95%置信區(qū)間(CI),進(jìn)行基因突變對(duì)此疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)度的估計(jì)。
結(jié)果:
1.本試驗(yàn)檢測(cè)的208例男性不育患者中Y染色體AZF區(qū)微缺失的有25例,缺失率為12.02%,而正常對(duì)照組無(wú)缺失發(fā)生,二者相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
2.無(wú)精組與少精組Y染色體AZF區(qū)微缺失之間差
11、異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3.AZFc微缺失有不同的臨床表型。
4.在河南漢族人群中,SHBG基因rs6259和rs727428位點(diǎn)基因型頻率的分布都符合Hardy-weinberg平衡(P>0.05),表明其具有良好的人群代表性。
5.在河南漢族人群中,rs6259位點(diǎn)在男性不育組和正常對(duì)照組相比,基因型頻率和等位基因頻率差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
6.對(duì)SHBG基因rs6259位點(diǎn)按照年齡進(jìn)
12、行分層分析,在25-35歲之間的男性不育組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
7.對(duì)rs6259位點(diǎn)進(jìn)行密度分組分析,GG基因型在輕度少精組和極重度少、無(wú)精組之間有顯著差異(P<0.05)。
8.在河南漢族人群中,rs727428位點(diǎn)在男性不育組和對(duì)照組相比,CC基因型頻率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
9.在河南漢族人群中,對(duì)rs6259A/G和rs727428 C/T。兩個(gè)位點(diǎn)
13、在男性不育組與正常對(duì)照組間進(jìn)行單倍型分析,發(fā)現(xiàn)A-T單倍型在兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。
10.rs727428位點(diǎn)多態(tài)性存在種族差異。
結(jié)論:
1.得出Y染色體AZF區(qū)微缺失是導(dǎo)致生精障礙的重要因素。
2.AZFc缺失有不同臨床表型。
3.相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)分析發(fā)現(xiàn),SHBG基因rs6259 A等位基因可能是河南漢族人群男性不育的遺傳危險(xiǎn)因子。
4
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