結(jié)核性腦膜炎患者腦脊液單核細胞內(nèi)結(jié)核抗原檢測的應用研究.pdf

1、目的：結(jié)核性腦膜炎(Tuberculous meningitis，TBM)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染性疾病，約占結(jié)核病的7～10％，是以腦膜、大腦實質(zhì)受損為主，并可波及脊髓、脊膜的非化膿性炎癥。TBM臨床癥狀復雜、不典型，早期影像學檢查無特異性改變，而賴以診斷顱內(nèi)感染的腦脊液生化、細胞學檢查結(jié)果往往與其它類型顱內(nèi)感染有所重疊，并不能簡單借以鑒別感染類型。MTB是

2、胞內(nèi)寄生菌，機體受到MTB感染后，其首先被單核巨噬細胞吞噬，故使用免疫學方法檢測腦脊液單核細胞內(nèi)的結(jié)核桿菌特異性抗原或許可作為TBM診斷的較為簡捷、敏感、并且特異性高的診斷方法。ESAT-6即6kDa早期分泌性抗原靶，是從MTB短期培養(yǎng)濾液中分離純化出的一種低分子量分泌性蛋白，在早期感染的單核細胞內(nèi)生長時，ESAT-6蛋白表達即明顯提高，因此推測檢測單核細胞內(nèi)ESAT-6具有更好的敏感性。本實驗第一部分選擇結(jié)核分枝桿菌早期分泌抗原ESA

3、T-6與PPD為檢測對象，采用免疫熒光細胞化學染色的方法觀察單核細胞的染色情況，判斷結(jié)核抗原的存在，而第二部分在以上基礎上通過激光掃描共聚焦顯微鏡技術(Laser scanning confocalmicroscope，LSCM)對部分TBM及對照組患者外周血及腦脊液單核細胞內(nèi)的ESAT-6進行檢測，同時對細胞做分層掃描，進行三維重建和ESAT-6相對熒光強度值測定而達到對細胞內(nèi)結(jié)核抗原的定性、定量、定位及動態(tài)變化分析，進一步探尋TBM

4、的發(fā)病機制。
　　方法：所有病例均來自寧夏醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科、寧夏結(jié)核病醫(yī)院2009年12月～2012年2月臨床診斷為結(jié)核性腦膜炎的住院患者，共60例。其中男性32例，女性28例；發(fā)病年齡16歲～76歲，中位值年齡28.5歲；選用Thwaites等提出的TBM臨床診斷標準作為納入標準。對所有患者均進行腦脊液常規(guī)、生化、細胞學檢查(MGG染色)和阿利新蘭染色。免疫熒光細胞化學法標記外周血及腦脊液單核細胞內(nèi)的PPD、ESAT-6

5、抗原。采用熒光顯微鏡進行觀察，部分涂片經(jīng)LSCM觀察并測定相對熒光強度。
　　結(jié)果：TBM組抗結(jié)核藥物治療前腦脊液標本MGG染色呈混合細胞學反應，淋巴細胞及激活淋巴細胞比例占主導；抗結(jié)核藥物治療15d腦脊液中性粒細胞計數(shù)略有減少，激活淋巴細胞比例明顯增加；抗結(jié)核藥物治療30d腦脊液標本MGG染色呈淋巴細胞為主的混合細胞學反應，中性粒細胞老化，激活淋巴細胞仍較多，并可見激活的單核細胞。PPD、ESAT-6熒光免疫細胞化學染色檢測結(jié)果

6、示：TBM組外周血(PB)及腦脊液單核細胞中PPD的陽性檢出率分別為63.3％(38/60)和83.33％(50/60)；對照組PB及腦脊液單核細胞中PPD的陽性檢出率分別是6.45％(4/62)和4.84％(3/62)。
　　TBM組PB及腦脊液單核細胞中ESAT-6的陽性檢出率分別為53.33％(32/60)和76.67％(46/60)；對照組PB及腦脊液單核細胞中ESAT-6陽性檢出率均為3.23％(2/62)。PPD和ES

7、AT-6在TBM患者中的檢出率均明顯高于非TBM患者。兩組相比有顯著統(tǒng)計學差異。ESAT-6較之PPD有著更好的特異性。
　　對20例ESAT-6陽性的TBM患者及20例ESAT-6陰性的對照組患者PB及腦脊液細胞涂片進行免疫熒光雙標記后在LSCM下觀察，結(jié)果見TBM組ESAT-6均勻分布于單核細胞胞漿和胞膜。陽性單核細胞體積略大，呈圓形或卵圓形。胞漿較松散，呈綠色熒光，而對照組陰性染色細胞則結(jié)合的熒光很少，普遍熒光強度極弱，所有

8、胞核均呈藍色。經(jīng)檢測，TBM組PB及腦脊液單核細胞ESAT-6平均熒光值分別為(22.45±13.35；26.55±11.34)，與對照組(2.45±0.89；2.22±0.37)相比有顯著統(tǒng)計學差異(P<0.01)。對20例TBM患者于治療3周后再次進行如上檢測，結(jié)果治療后的ESAT-6平均熒光值明顯降低，治療前后比較有統(tǒng)計學差異。
　　結(jié)論：(1)初步建立了利用免疫熒光細胞化學法檢測TBM單核細胞內(nèi)抗原的方法。(2)ESAT-