GⅡ-4型諾如病毒P粒子制備及HBGAs相關(guān)性研究.pdf

1、目的：分析GII-4型諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列，了解其基因結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)以及基因組類型。應(yīng)用分子生物學(xué)手段制備GII-4型NoV P粒子，通過酶免疫分析試驗(yàn)（Enzyme immune assays，EIA）為基礎(chǔ)的唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)和寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析我國主要基因型95/96 US株、2006b株、Sydney株等3種毒株與組織血型抗原（Histo-blood group antigens，HBGAs）的相關(guān)性，以獲得我國N

2、oV流行株與HBGAs的結(jié)合模式，從而確定諾如病毒流行株感染的宿主范圍，為進(jìn)一步研究NoV與宿主受體之間的關(guān)系及NoV疫苗和防治藥物的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。
　　方法：1、諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測(cè)定及分析：依據(jù)Sydney2012全基因組參考株進(jìn)行引物的設(shè)計(jì)，用RT-PCR分段的方式對(duì)諾如病毒全基因組進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)過分子克隆的手段、測(cè)序以后再進(jìn)行系統(tǒng)的進(jìn)化分析。2、制備GII-4型諾如病毒P粒子：選擇S

3、ydney2012代表株3135，通過基因工程方法構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pGEX4T1-P，將鑒定正確的pGEX4T1-P質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)菌，挑選單克隆菌落小量表達(dá)，SDS-PAGE鑒定是否有融合蛋白產(chǎn)生。隨后將保存菌種活化進(jìn)行目的蛋白的大量表達(dá)，利用瓊脂糖-4B柱對(duì)P蛋白進(jìn)行純化并通過凝血酶除去GST融合蛋白標(biāo)簽以形成二十四聚體的P粒子。3、分析不同型別諾如病毒株與組織血型抗原的親和性：利用ELISA唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析3個(gè)型別的諾

4、如病毒流行株與唾液中的HBGAs受體相結(jié)合的情況。利用HBGAs表型已明確的54份唾液樣本包被96孔酶標(biāo)板，加純化的NoV P粒子與之反應(yīng)，以相應(yīng)的鼠抗GII-4 NoV P血清為一抗，二抗為HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，加入TMB顯色液，在酶標(biāo)儀上的450nm波長處顯示的OD值。通過3個(gè)毒株的P蛋白對(duì)lea、leb、lex、ley、A、B、H1和H2型寡糖進(jìn)行EIA為基礎(chǔ)的寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)。綜合唾液結(jié)合及寡糖結(jié)合的實(shí)驗(yàn)分析三個(gè)諾如病毒流行株

5、與HBGAs受體的結(jié)合方式。
　　結(jié)果：1、諾如病毒廣州株GZ20133135全基因組序列測(cè)定及分析：GII-4型諾如病毒廣州株GZ20133135病毒基因組全長7566bp，其病毒基因組分為三個(gè)開放閱讀框（ORFs），ORF1、ORF2及 ORF3長度分別為5100bp、1623bp和807bp，ORF1與ORF2之間有19個(gè)核苷酸重疊。廣州株GZ20133135全基因組的序列與參考株GII-4型Sydney2012變異株序列的

6、同源性最高，全長同源性為99.07％。通過系統(tǒng)的進(jìn)化分析表明，廣州株GZ20133135株屬于GII-4 Sydney2012的變異株。通過對(duì)衣殼區(qū)541個(gè)氨基酸比對(duì)，Sydney2012變異株位點(diǎn)變化情況為：aa294 V或A或P→T，aa296 S或T→S,aa297H或Q→R，aa298D或N或T→N,aa368 T或N或S或A→E,aa372 N或S→D,aa393 N或D或S,aa394 T或G或S→T,aa395 T或A→T

7、,aa407 N或D→S,aa412 T或D→N,aa413 G或I→T。2、制備GII-4型諾如病毒P粒子：PCR擴(kuò)增得到3135 P區(qū)序列，大小都為991bp。成功構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒4T1-3135 P，測(cè)序結(jié)果證實(shí)連接的表達(dá)片段長為972個(gè)核苷酸，編碼324個(gè)氨基酸。SDS-PAGE電泳分析證實(shí)成功表達(dá)了分子量約62kDa的可溶性的GST-P融合蛋白和分子量為36kDa的目的蛋白P蛋白。3、分析不同型別諾如病毒株與組織血型抗原的親和性：

8、通過P蛋白的唾液結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析得到3135-P、9711-P和55019-P諾如病毒與唾液HBGAs的結(jié)合模式。9711及55019株的P粒子與A、B、AB、O+型唾液能夠結(jié)合，而與O-型唾液則均不結(jié)合。3135株P(guān)粒子與A、B、AB、O+、O-型唾液均結(jié)合。通過寡糖結(jié)合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)3135與lea、leb、A、B、H2型結(jié)合；55019與leb、ley、A、B、H2型寡糖結(jié)合；9711與leb、ley、A、B型寡糖結(jié)合。
　　結(jié)論：1