長牡蠣中諾如病毒受體類HBGAs的分離鑒定及環(huán)境對其表達(dá)的影響.pdf

1、食品的生物性污染所造成的食源性疾病已成為影響食品安全的突出問題，日益受到全球各國的關(guān)注。諾如病毒（Noroviruses，NoVs）是一種引發(fā)人類非細(xì)菌性急性胃腸炎的主要病原體，近年來在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)流行趨勢，嚴(yán)重時可導(dǎo)致患者死亡，給消費(fèi)者健康造成了巨大威脅。牡蠣肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，產(chǎn)量巨大，2015年我國牡蠣養(yǎng)殖面積已達(dá)14萬公頃，比2014年增長6.1％，牡蠣養(yǎng)殖總產(chǎn)量超過457萬噸，占我國貝類養(yǎng)殖總產(chǎn)量的33.03%。然而，牡蠣作

2、為NoVs的重要傳播媒介，是公認(rèn)的引起病毒性急性胃腸炎疫情暴發(fā)的高風(fēng)險食品，大量的調(diào)查研究結(jié)果顯示，大多數(shù)貝類引發(fā)的NoVs疫情與食用牡蠣相關(guān)，且常規(guī)的貝類凈化加工方法難以有效地將NoVs從牡蠣體內(nèi)除去。人體組織血型抗原（Histo-Blood Group Antigens，HBGAs）是人類結(jié)合NoVs的受體，在不同人體對NoVs易感性的差異中起著重要作用。Tian等研究發(fā)現(xiàn)，牡蠣中也存在人 HBGAs類似物特異性結(jié)合NoVs，這可能

3、是牡蠣體內(nèi)富集NoVs的原因。
　　本研究從NoVs在長牡蠣(Crassostrea gigas)中的結(jié)合受體角度出發(fā)，通過比較5種常用糖蛋白的浸提方法，分別建立了長牡蠣內(nèi)臟和鰓中類HBGAs的提取方法；運(yùn)用建立的提取方法結(jié)合ELISA檢測方法，對長牡蠣類HBGAs進(jìn)行了組織分布與分型檢測；通過改變溫度和鹽度的牡蠣養(yǎng)殖條件，分析了長牡蠣內(nèi)臟和鰓中主要型別類HBGAs及類FUT2基因的表達(dá)變化；通過DEAE Sepharose FF

4、陰離子交換層析色譜和SepharcrylTM S-300凝膠色譜對長牡蠣類A型HBGA進(jìn)行了初步分離純化，并運(yùn)用MALDI-TOF-TOF-MS、紅外光譜、GC/MS及單糖組成分析等分析方法對長牡蠣類A型HBGA的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了初步探索，為進(jìn)一步研究長牡蠣富集NoVs的機(jī)制提供了理論研究基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)論如下：
　　1.優(yōu)化了長牡蠣類HBGAs的提取方法，對其內(nèi)臟和鰓中的類HBGAs進(jìn)行了分型。在長牡蠣類 HBGAs提取的方法優(yōu)化

5、中以水作為浸提液提取牡蠣類HBGA的方法優(yōu)于以PBS為浸提液的提取方法，且不同組織中類HBGAs的提取方法不同；運(yùn)用建立的方法對24份（240只）長牡蠣進(jìn)行檢測分型，發(fā)現(xiàn)長牡蠣內(nèi)臟和鰓中的類 HBGAs存在多態(tài)性的特點(diǎn)，并首次發(fā)現(xiàn)了類 Leb型HBGA在長牡蠣鰓中穩(wěn)定表達(dá)（檢出率為91.7%），類A型HBGA在長牡蠣內(nèi)臟和鰓中穩(wěn)定表達(dá)（檢出率分別為100%和83.3%）；
　　2.研究了溫度鹽度對牡蠣類HBGAs及其合成關(guān)鍵基因表

6、達(dá)的影響。在對長牡蠣內(nèi)臟和鰓中主要型別類HBGAs及類FUT2基因的表達(dá)受溫度鹽度影響的分析中，發(fā)現(xiàn)長牡蠣內(nèi)臟中類A型HBGA及類FUT2基因的表達(dá)量在低溫和高鹽的條件下顯著增加，這與諾如病毒疫情暴發(fā)的季節(jié)相吻合，間接表明了諾如病毒疫情暴發(fā)的季節(jié)性與長牡蠣類 FUT2基因的表達(dá)量及類 HBGAs的表達(dá)量均存在一定的相關(guān)性。
　　3.牡蠣內(nèi)臟中類A型HBGA的分離純化。運(yùn)用DEAE-sepharose fast flow陰離子交換層

7、析色譜法對長牡蠣內(nèi)臟類HBGAs粗提取液進(jìn)行分離純化，獲得F1和F2兩部分純化組分，將F2樣品利用Sepharcryl S-300凝膠色譜進(jìn)一步分離純化，獲得純化組分 YY1用于單糖組成分析、氣質(zhì)聯(lián)用、紅外光譜等實(shí)驗(yàn)。
　　4.初步探索了長牡蠣類A型HBGA的結(jié)構(gòu)。將F1和F2組分進(jìn)行SDS-PAGE分離及Western Blot驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)長牡蠣類A型HBGA的分子量大于180kDa，且其與人A型HBGA的分子量存在明顯的差異，表

8、明長牡蠣類A型HBGA與人A型HBGA的結(jié)構(gòu)可能存在一定的差異性；對長牡蠣類A型HBGA的SDS-PAGE條帶進(jìn)行MALDI-TOF-TOF-MS分析，通過Mascot2.3分析軟件分析所得數(shù)據(jù)，結(jié)果顯示有兩種匹配蛋白，20條多肽序列，其中3條肽段的可信度單獨(dú)超過 scores值，其多肽序列為 VYDLEFVFDYRDDYAR， DNPEQPDIPELPTETFVVNR和AQSIEDTNSEGPVVQDTALAVLR；對YY1組分進(jìn)行紅