真菌果膠甲基酯酶的重組制備及性質(zhì)表征.pdf

1、果膠是一類富含多聚半乳糖醛酸的天然高分子化合物，是植物細胞壁的重要組成部分。果膠甲基酯酶能催化果膠的半乳糖醛酸鏈上的甲氧基去甲氧基化，因此具有降解果膠的活性。黑曲霉來源的果膠甲基酯酶在果汁生產(chǎn)中可以有效控制果汁的澄清和渾濁，但黑曲霉能產(chǎn)生多種果膠酶，這些酶的生化性質(zhì)相似，為果膠甲基酯酶的純化帶來困難，重組制備黑曲霉果膠甲基酯酶是一種可行、有效的方法。另一方面，黃曲霉分泌的果膠甲基酯酶是黃曲霉侵染植物時的致病因子之一，抑制該酶活性可控制黃

2、曲霉對作物的侵染。另外，真菌來源的果膠甲基酯酶的催化機制與細菌及植物來源的不同，有必要研究真菌果膠甲基酯酶的結(jié)構(gòu)和功能，但真菌果膠甲基酯酶的晶體結(jié)構(gòu)還未見報道。 因此，本論文以黑曲霉果膠甲基酯酶和黃曲霉果膠甲基酯酶為研究對象，分別對這2個酶進行了重組制備及性質(zhì)表征。
　　(1)黑曲霉果膠甲基酯酶的克隆表達、分離純化及性質(zhì)表征
　　克隆了黑曲霉果膠甲基酯酶基因，利用組成型表達載體pGAPZα在畢赤酵母中成功地分泌表達了

3、該酶，而且無需甲醇誘導(dǎo)，避免了工業(yè)上甲醇誘導(dǎo)的不便。利用HiTrapTMQXL陰離子交換柱層析和Resource S陽離子柱層析分離純化得到電泳純蛋白，其中比活力為342 U/mg，蛋白純化活力回收率為28％。對純化后的重組酶進行了性質(zhì)分析，得到Vmax為1.376 mmol/(min×mg),Km為0.19％ pectin(w/v)≈8.6mmol/L,Kcat為8.26×103 S-1,最適溫度為50℃，最適pH為4.7，且該酶在3

4、0-50℃、pH4.0-6.0穩(wěn)定性較好。該酶能夠被K+、Mg2+、Co2+、Mn2+、Ni2+離子抑制活性，Na+對酶活力沒有影響。
　　(2)黃曲霉果膠甲基酯酶的重組表達、分離純化及其抑制劑篩選
　　利用載體pPIC9在畢赤酵母GS115中表達了黃曲霉果膠甲基酯酶基因。通過親和色譜層析和離子交換兩步純化，得到了電泳純的重組黃曲霉果膠甲基酯。對該酶進行了性質(zhì)分析，其最適pH為4.8，最適溫度為55℃，同時發(fā)現(xiàn)該酶對中等甲酯

5、化度果膠表現(xiàn)出更強催化活性。通過抑制劑篩選，發(fā)現(xiàn)帶有五倍子酸基團的植物多酚(EGCG)和綠茶提取物多酚(PP60)對該酶有抑制活性。
　　(3)黑曲霉果膠甲基酯酶的原核表達及結(jié)晶條件研究
　　黑曲霉果膠甲基酯酶和黃曲霉果膠甲基酯酶在畢赤酵母細胞中的表達，都存在不均一性的糖基化現(xiàn)象，糖基化不均一的蛋白質(zhì)很難形成結(jié)晶，所以采用在大腸桿菌原核系統(tǒng)里表達這2個酶。研究發(fā)現(xiàn)黃曲霉果膠甲基酯酶在大腸桿菌中以包涵體的形式表達，而黑曲霉果膠