替西羅莫司協(xié)同順鉑對宮頸癌Hela細胞的作用及其機制研究.pdf

1、背景：宮頸癌作為一種嚴重威脅女性健康的疾病，由于其具有易復發(fā)、易轉(zhuǎn)移的特點，使得宮頸癌的化學藥物療法日益受到關(guān)注。治療中使用到的化療藥物以鉑類為主，雖然化療效果值得肯定，但毒副作用明顯，易發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移、耐藥等困擾，臨床極為期待新的有效的化療組合方案。已有研究證明，mTOR抑制劑雷帕霉素及其類似物依維莫司和替西羅莫司都可以和順鉑聯(lián)合使用，是治療腫瘤的潛在組合藥物。mTOR抑制劑主要以mTOR蛋白為靶點有效地抑制腫瘤細胞的增殖生長，促進腫瘤

2、細胞的凋亡，逆轉(zhuǎn)腫瘤細胞對化療藥物順鉑的耐藥性。盡管越來越多的證據(jù)表明mTOR抑制劑與順鉑這種聯(lián)合治療在抗腫瘤領(lǐng)域應用的巨大潛力，但是替西羅莫司與順鉑的聯(lián)合使用對宮頸癌的研究并無報道，且對其詳細的作用機制尚不清楚。
　　目的：本課題在細胞水平，考察替西羅莫司與順鉑對宮頸癌Hela細胞的有效性，篩選出最佳的藥物聯(lián)用組合方案，同時探索替西羅莫司與順鉑聯(lián)合作用的機制。
　　方法：
　　1.采用MTT比色法考察替西羅莫司與順鉑

3、單獨或聯(lián)合作用于對宮頸癌Hela細胞24h、48h、72h的抗增殖活性，計算半數(shù)抑制濃度IC50，篩選出最優(yōu)的組合方案；
　　2.采用流式細胞術(shù)考察替西羅莫司與順鉑聯(lián)合作用對宮頸癌Hela細胞的誘導凋亡作用及周期阻滯作用，探討聯(lián)用組合方案的有效性；
　　3.采用Transwell小室模型考察替西羅莫司與順鉑聯(lián)合作用對宮頸癌Hela細胞的抗侵襲能力，考察聯(lián)用組合方案對腫瘤微環(huán)境的影響。
　　4.采用Western Blo

4、t法考察替西羅莫司與順鉑單獨或聯(lián)合應用對宮頸癌Hela細胞中mTOR信號通路相關(guān)蛋白mTOR、70s6k、4EBP1，周期相關(guān)蛋白cyclinD1及凋亡相關(guān)蛋白cleaved-PARP、bcl-2的表達水平的影響。
　　結(jié)果：
　　1.MTT結(jié)果表明替西羅莫司與順鉑聯(lián)合作用于宮頸癌Hela細胞顯示出優(yōu)于單獨給藥處理的抗增殖活性。經(jīng)過對半數(shù)抑制濃度IC50的計算，結(jié)果顯示在加入替西羅莫司時，Hela細胞對順鉑的敏感度增強，聯(lián)用

5、組合IC50值為0.726±0.550，相較于順鉑單藥（1.115±0.239）有所降低。此外，通過對聯(lián)合指數(shù)CI的計算可知聯(lián)用組合方案主要表現(xiàn)出協(xié)同效應（CI<1）。
　　2.流式細胞術(shù)檢測替西羅莫司與順鉑聯(lián)合對宮頸癌Hela細胞的促凋亡作用結(jié)果顯示，替西羅莫司與低濃度的順鉑聯(lián)合作用時，其凋亡率提升至34.617±3.201％，顯著高于兩種藥物單獨處理的凋亡率
　　3.流式細胞術(shù)檢測替西羅莫司與順鉑聯(lián)合的周期阻滯作用結(jié)果顯

6、示，聯(lián)合用藥組導致了細胞周期的重新分布，明顯抑制了G2/M期細胞的轉(zhuǎn)化，引發(fā)S期檢查點失調(diào)，導致S期細胞的聚集積累。0.75μg/mL順鉑單獨處理48h后的Hela細胞表現(xiàn)出均勻分布在G2期（45.01±4.1%）和S期（42.87%±6.78%），在加入0.05μmol/L和0.1μmol/L替西羅莫司后，G2期細胞百分比為30.21±3.56%、34.94±5.04%，S期細胞百分比為61.62±6.60%、56.42±4.89%。

7、
　　4.Transwell小室模型考察聯(lián)合用藥組對宮頸癌Hela細胞侵襲能力的結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥可以有效抑制細胞的侵襲能力。這一結(jié)果說明二者的聯(lián)合作用在腫瘤微環(huán)境中起到了一定的抗血管生成作用。
　　5.Western Blot法檢測mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑關(guān)鍵蛋白的表達結(jié)果表明，聯(lián)合用藥組主要是通過對mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑的介導，抑制其下游蛋白70s6k、4EBP1的磷酸化，阻斷腫瘤細胞的生存通路來協(xié)同順鉑發(fā)揮細胞毒性。同時，替

8、西羅莫司與順鉑聯(lián)合作用可以有效地降解DNA修復酶PARP，抑制負調(diào)控凋亡蛋白bcl-2的表達并抑制細胞周期蛋白家族cyclinD1蛋白的表達從而調(diào)控細胞周期分布。
　　結(jié)論：實驗結(jié)果表明替西羅莫司可以協(xié)同順鉑增強其抗宮頸癌細胞的活性，主要是通過PI3K/AKT/mTOR信號轉(zhuǎn)導途徑發(fā)揮二者協(xié)同效應。另一方面，替西羅莫司通過抑制細胞周期蛋白家族的cyclinD1蛋白的表達，阻止其與細胞周期蛋白依賴激酶相結(jié)合，調(diào)節(jié)酶活性協(xié)調(diào)周期進程，