剪切應(yīng)力引起的細(xì)胞膜表面張力變化的可視化研究.pdf

1、碩士學(xué)位論文剪切應(yīng)力引起的細(xì)胞膜表面張力變化的可視化研究1【7●1●■●o●‘111●VlSUallZation0ISnearStI℃ssmnUcenaItematlonofcellmembranesurfacetension學(xué)號：21309206大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology人連理上人學(xué)學(xué)術(shù)學(xué)位碩士學(xué)位論文摘要目標(biāo)：血流剪切應(yīng)力對腫瘤細(xì)胞的定向作用可能是引起腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移的重要原因之一。剪切應(yīng)力作用

2、于細(xì)胞膜上表面，首先引起細(xì)胞膜表面張力的改變，這種物理改變可能是腫瘤細(xì)胞定向遷移的基礎(chǔ)，但目前尚未有針對剪切應(yīng)力作用下腫瘤細(xì)胞膜表面張力的分布模式的研究。本文將采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FluorescenceResonanceEnergyTransfer，F(xiàn)RET)技術(shù)對剪切應(yīng)力引起的細(xì)胞膜表面張力變化模式及其相關(guān)機制進(jìn)行探究。方法：本文首先采用常規(guī)亞克隆技術(shù)，利用具備分子彈簧功能的蜘蛛絲蛋白序列(GPGGA)8及一對可以發(fā)生FRET的熒

3、光蛋白ECFP／YPet設(shè)計制備可以可視化檢測細(xì)胞膜表面張力變化的FRET探針，并通過人為改變細(xì)胞膜表面張力對該探針進(jìn)行了驗證。其次采用平行平板流動腔對HeLa細(xì)胞施加不同人小的定常層流剪切應(yīng)力，并且利用多種試劑作用于細(xì)胞膜和細(xì)胞骨架，在FRET熒光顯微鏡下動態(tài)記錄單個細(xì)胞的表面熒光FRET變化。然后通過MebaFluor軟件處理熒光照片，得到細(xì)胞FRETratio圖像的整體趨勢，而后采用MATLAB軟件編程，把細(xì)胞圖像沿著力的方向分成

4、50等份，得到細(xì)胞膜上表面張力的局部變化數(shù)據(jù)，并采用Hill方程擬合沿流體方向的FRET數(shù)據(jù)，探究剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力的局部分布變化規(guī)律。結(jié)果：探針的FRETratio變化可以反映細(xì)胞膜表面張力的動態(tài)變化：在層流剪切應(yīng)力的作用下，細(xì)胞膜表面張力沿流體方向呈現(xiàn)中游高、上下游低的分布模式，細(xì)胞膜表面張力整體水平增高，其幅度與剪切應(yīng)力大小呈現(xiàn)正相關(guān)，且最高點所在位置隨力的增大向細(xì)胞上游偏移，上游增高幅度大于下游；加載剪切應(yīng)力之前人為改

5、變細(xì)胞膜流動性，苯甲醇處理會使得細(xì)胞膜表面張力升高更顯著，而膽固醇作用后細(xì)胞膜表面張力整體下降明顯，但仍然呈現(xiàn)與對照組類似的上下游非均勻性分布變化。采用Nocodazole、CytochalasinD及ML7分別破壞細(xì)胞骨架微管、微絲或抑制微絲收縮，細(xì)胞膜表面張力在剪切應(yīng)力作用下仍呈現(xiàn)中間高而上下游偏低的模式；破壞微管使剪切應(yīng)力作用下細(xì)胞膜表面張力的整體增高受到明顯抑制，并且局部分布發(fā)生了明顯變化，最高值幅度有所下降而且向上游側(cè)偏移，而