胰島素增敏劑bpv加重病理性心肌損害的機(jī)制研究.pdf

1、背景：心肌的體積增大按照其誘因可分為三種：心肌的正常生長(zhǎng)、生理性心肌肥大和病理性心肌肥大。與臨床上有關(guān)的是生理性心肌肥大和病理性心肌肥大。生理性心肌肥大多是由慢性靜力訓(xùn)練或者妊娠引起的，而病理性心肌肥大則是由多種致病因素如高血壓，心腔疾病，心肌梗死及基因突變等造成的，病理性心肌肥大的初期對(duì)機(jī)體是有益的，但在晚期發(fā)生心肌代償作用，導(dǎo)致心衰。通過(guò)提高機(jī)體的心肌生理性心肌肥大來(lái)拮抗病理性心肌肥大的研究發(fā)現(xiàn)為預(yù)防和治療心衰提供了一條新思路。厘清

2、生理性心肌肥大發(fā)生的機(jī)制，使得我們能夠發(fā)現(xiàn)治療病理性心肌肥大和心衰的新的藥物靶點(diǎn)。釩化合物bpv(phen)，一類高活性胰島素增敏劑，是糖尿病潛在的治療試劑，這類化合物能抑制PTEN(Phosohatase and tension homologue deleted on chromosome10)，增強(qiáng)胰島素信號(hào)通路。而在心肌細(xì)胞中，PTEN同樣調(diào)控著生存有關(guān)的信號(hào)通路。本論文所要探索的是利用PTEN的抑制劑能否誘導(dǎo)生理性心肌肥大，從

3、而抑制病理性心肌肥大。
　　 目的：驗(yàn)證釩化合物bpv(phen)對(duì)病理性心肌肥大的作用，以及其可能的機(jī)制。
　　 方法：主體實(shí)驗(yàn)采用分離新生大鼠心肌細(xì)胞，異丙腎上腺素ISO(10μM)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的病理性心肌肥大，應(yīng)用免疫熒光檢測(cè)心肌細(xì)胞面積的變化和病理性心肌肥大的蛋白指標(biāo)ANF的表達(dá)量變化，同時(shí)Real-time PCR進(jìn)一步檢測(cè)ANF的表達(dá)量以驗(yàn)證病理性心肌肥大模型的建立。在病理性心肌肥大的細(xì)胞模型建立的基礎(chǔ)上，用

4、免疫熒光和Real-time PCR驗(yàn)證釩化合物bpv(phen)對(duì)ANF表達(dá)量的影響，以及生理性心肌肥大指標(biāo)PGC1-α表達(dá)量的變化；PI染色檢測(cè)bpv(phen)對(duì)心肌細(xì)胞的致死作用；western blot檢測(cè)bpv(phen)對(duì)生理性心肌肥大信號(hào)通路中p-Akt表達(dá)量的影響；以及免疫熒光檢測(cè)bpv(phen)對(duì)病理性心肌肥大信號(hào)通路中NFAT入核量的影響。SiRNA敲除技術(shù)驗(yàn)證PLC在bpv(phen)加重病理性心肌損傷的過(guò)程中

5、所發(fā)揮的作用；RT-PCR檢測(cè)SiRNA的敲除效率，Real-time PCR和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)敲除PLC之后bpv(phen)對(duì)ANF表達(dá)量的影響。同時(shí)本論文采用ISO(40μg/天)皮下注射和腹主動(dòng)脈狹窄(TAC)誘導(dǎo)病理性心肌肥大的動(dòng)物模型進(jìn)行整體實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。通過(guò)記錄動(dòng)物模型的生存曲線和心重體重比，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)ANF的表達(dá)量，以及HE染色和天狼星紅染色檢測(cè)心肌的纖維化和壞死來(lái)驗(yàn)證病理性心肌肥大動(dòng)物模型的造模成

6、功；同時(shí)還采用相同的實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)了bpv(phen)對(duì)這兩種病理性心肌肥大動(dòng)物模型的作用。最后的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用IQ5，Image J，Excel，SPSS等軟件進(jìn)行分析。
　　 結(jié)果：10μM的ISO處理導(dǎo)致心肌細(xì)胞面積的增大和病理性心肌肥大的蛋白標(biāo)志ANF表達(dá)上調(diào)9.6倍，驗(yàn)證了病理性心肌肥大的細(xì)胞模型的成功。同ISO相比，有效濃度(0.1μM-4μM)的胰島素增敏劑bpv(phen)導(dǎo)致ANF的表達(dá)上調(diào)，而生理性心肌肥大的蛋白標(biāo)

7、志PGC1-α的表達(dá)并無(wú)上調(diào)。通過(guò)胰島素(1μg/mL)的處理增強(qiáng)bpv的效果，亦或是加入病理性心肌肥大信號(hào)通路PKC/PKD的抑制劑6976，ANF的表達(dá)量都比單獨(dú)ISO處理要高，而PGC1-α的表達(dá)無(wú)變化。探求bpv(phen)作用的分子機(jī)制，發(fā)現(xiàn)通過(guò)western blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了bpv處理能提高p-Akt的表達(dá)水平，同時(shí)通過(guò)SiRNA敲除PLC，能部分抑制bpv上調(diào)ANF的表達(dá)。同時(shí)，bpv還能促進(jìn)NFAT的入核，導(dǎo)致病理性心

8、肌肥大的基因表達(dá)上調(diào)。我們還利用ISO和主動(dòng)脈狹窄(TAC)誘導(dǎo)病理性心肌肥大實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了bpv不但能上調(diào)病理性心肌肥大的蛋白marker ANF，NFAT等的表達(dá)，還能造成心肌的纖維化和壞死。
　　 結(jié)論：與我們的假設(shè)相反，胰島素增敏劑并沒(méi)有通過(guò)增加生理性肥大來(lái)減輕病理性肥大，反而加重了病理性肥大。相關(guān)的機(jī)制是：bpv抑制了PTEN的作用，導(dǎo)致細(xì)胞膜PIP3濃度升高，后者通過(guò)激活PLC，產(chǎn)生大量IP3和DAG，進(jìn)而導(dǎo)致CaN-N