貴陽市耐多藥結(jié)核分枝桿菌耐藥突變特征及散在分布重復(fù)單位基因分型.pdf

1、目的：了解貴陽地區(qū)耐多藥結(jié)核分枝桿菌rpoB基因、katG基因、inhA啟動(dòng)子和oxyR-aphc間隔區(qū)基因突變特征，為耐藥基因芯片法檢測的完善和推廣應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)；應(yīng)用分枝桿菌散在重復(fù)單位分型法（MIRU）對86株結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行分子分型，了解本地結(jié)核分枝桿菌耐多藥分子分型特征；比較 MIRU12個(gè)位點(diǎn)對本地菌株進(jìn)行分子分型的分辨率。
　　方法:
　　1、采用羅氏培養(yǎng)法從患者痰標(biāo)本中分離培養(yǎng)結(jié)核分枝桿菌，以間接比例法檢測

2、結(jié)核分枝桿菌臨床菌株對異煙肼、利福平的敏感性；
　　2、提取結(jié)核分枝桿菌DNA，對31株結(jié)核分枝桿菌臨床分離株(耐多藥17株，敏感株14株)的rpoB基因、katG基因、inhA啟動(dòng)子和oxyR-aphc間隔區(qū)進(jìn)行DNA片段的PCR擴(kuò)增，并進(jìn)行測序分析；
　　3、在GenBank中下載H37Rv的rpoB基因、katG基因、inhA啟動(dòng)子和oxyR-aphc間隔區(qū)序列與氨基酸序列，采用CLC Free Workbench4.

3、5進(jìn)行比對分析，了解本地區(qū)耐藥相關(guān)rpoB基因、katG基因、inhA啟動(dòng)子和oxyR-aphc間隔區(qū)基因突變的多樣性；
　　4、分別對86株結(jié)核分枝桿菌（耐多藥菌株46株，敏感菌株40株）MIRU12個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物以2.0％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，使用100bp DNA Ladder做標(biāo)志。應(yīng)用凝膠成像儀分析擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，計(jì)算相應(yīng) MIRU位點(diǎn)的拷貝數(shù)。選取部分菌株 MIRU12個(gè)位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測序，以在

4、線重復(fù)序列分析軟件對各序列分析散在分布重復(fù)單位拷貝數(shù);
　　5、利用NTsys2.10e軟件對全部基因型數(shù)字化的結(jié)果行非加權(quán)組平均法（UPGMA）聚類分析。計(jì)算各 MIRU位點(diǎn)分辨力大小;
　　6、應(yīng)用卡方檢驗(yàn)檢測年齡、性別及基因型與本地結(jié)核分枝桿菌耐多藥相關(guān)性。
　　結(jié)果：
　　1、17株結(jié)核分枝桿菌耐多藥菌株中有12株檢出rpoB基因變異，其中7株為531位TCG→TTG變異，2株為CAC526TAC變異,A

5、TC533TTC、ATC565TTC變異各1株，1株為CTG530ATG與TCG526TTC聯(lián)合突變，5株耐多藥菌株rpoB基因沒有檢出突變。敏感菌株均未檢出變異。rpoB530和565變異位點(diǎn)存在于基因芯片法檢測范圍外。
　　2、17株耐多藥結(jié)核分枝桿菌中有16株檢出katG基因突變，其中70.5%(12/17)為315位密碼子變異，且變異類型均為 AGC→ACC，敏感株未發(fā)現(xiàn)315位點(diǎn)突變。11株敏感菌和4株耐藥菌在katG4

6、63位密碼子發(fā)生變異，變異類型均為CGG→TGG，變異率分別為78.6%（11/14）和23.5%(4/17)，敏感菌和耐藥菌變異率相比，χ2值為6.28，P＞0.05，差異無顯著性。有12株耐藥株的變異類型為 katG基因雙重位點(diǎn)突變，其中10株為 katG315(AGC→ACC)和463(CGG→TGG)位變異，463(CGG→TGG)和299(GGC→AGC)變異及463(CGG→TGG)和419(GAC→CAC)位變異各1株。2

7、株異煙肼耐藥菌檢出oxyR-aphC啟動(dòng)區(qū) G32A突變，其中1株為聯(lián)合 katG463和299位突變。katG299,419及oxyR-aphC-G32A位點(diǎn)變異在基因芯片檢測法范圍外。
　　3、MIRU12位點(diǎn)法將86株結(jié)核分枝桿菌分為I，II，III，IV四個(gè)基因群，75個(gè)基因型，其中70個(gè)獨(dú)立基因型。I群包含結(jié)核分枝桿菌64株，占全部菌株的74.40%，為本地的優(yōu)勢菌株。I群中耐多藥結(jié)核分枝桿菌36株，敏感菌株28株。

8、r>　　4、除70株獨(dú)立基因型外的16株菌分型成5簇，最大簇包含5株菌，最小簇包含2株菌。成簇率為18.60%。
　　5、12個(gè)MIRU位點(diǎn)中，位點(diǎn)26、31顯示高等程度多態(tài)性，其中位點(diǎn)26顯示多態(tài)性最高，h為0.704；位點(diǎn)3l，10，39，16，40，23，2顯示中等程度的多態(tài)性；位點(diǎn)4，20，27，24顯示較低多態(tài)性；位點(diǎn)24只有一種等位基因型。6、經(jīng)卡方檢驗(yàn)，不同性別、年齡及基因型別菌株耐多藥率經(jīng)χ2檢驗(yàn)，χ2值分別為6.

9、48，6.48，10.23，P均大于0.05。
　　結(jié)論：
　　1、貴陽耐多藥結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥基因突變主要的變異類型為rpoB531及rpoB526位點(diǎn)突變；
　　2、貴陽耐多藥結(jié)核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變主要的變異類型為katG315位點(diǎn)突變；
　　3、貴陽耐多藥結(jié)核分枝桿菌存在芯片（博奧生物有限公司）法檢測不涵蓋的耐藥基因突變；
　　4、貴陽市結(jié)核分枝桿菌具有遺傳多樣性，I群為本地結(jié)核分枝桿菌主