HDAC5在有氧運(yùn)動(dòng)改善胰島素抵抗中的作用.pdf

1、研究目的：
　　胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病(T2DM)等多代謝性疾病的病理生理學(xué)基礎(chǔ)，IR的發(fā)生發(fā)展與機(jī)體脂代謝異常密切相關(guān)。有氧運(yùn)動(dòng)可通過(guò)增加骨骼肌代謝相關(guān)基因的表達(dá)促進(jìn)脂肪酸有氧氧化，減少骨骼肌脂毒性，從而改善 IR。但有氧運(yùn)動(dòng)如何調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因表達(dá)機(jī)制尚不清楚。組蛋白去乙酰化酶5(HDAC5)在有氧運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的骨骼肌肌纖維類(lèi)型轉(zhuǎn)換中的重要作用。肌肉增強(qiáng)因子2(MEF2)的轉(zhuǎn)錄活性受到 HDAC5的抑制，許多代謝相關(guān)基因含

2、有與MEF2增強(qiáng)子區(qū)域結(jié)合的保守序列，推測(cè)運(yùn)動(dòng)可能通過(guò) HDAC5/MEF2調(diào)節(jié)代謝相關(guān)基因的表達(dá)。肉堿棕櫚酸轉(zhuǎn)移酶1(CPT1b)被認(rèn)為長(zhǎng)鏈脂肪酸(LCFA)進(jìn)入線(xiàn)粒體唯一的限速酶，在增加骨骼肌長(zhǎng)鏈脂肪酸β-氧化，減少脂毒性中起關(guān)鍵作用；CPT1b基因啟動(dòng)子區(qū)域含有 MEF2保守結(jié)合位點(diǎn)，運(yùn)動(dòng)是否通過(guò)HDAC5/MEF2增強(qiáng) CPT1b基因表達(dá)尚不清楚。HDAC5受一磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)的調(diào)控，AMPK是細(xì)胞內(nèi)的能量感受器

3、，運(yùn)動(dòng)可以通過(guò)激活A(yù)MPK Thr172位點(diǎn)的磷酸化引起其下游信號(hào)通路的活化，促進(jìn)脂肪β-氧化。綜上所述，本課題的研究目的為：(1)明確有氧運(yùn)動(dòng)是否可以調(diào)節(jié)正常及 IR小鼠骨骼肌 HDAC5活性；(2)明確 HDAC5是否參與脂肪酸有氧氧化的關(guān)鍵蛋白CPT1b的表達(dá)調(diào)控；(3)探討運(yùn)動(dòng)是否通過(guò) AMPK介導(dǎo) HDAC5活性的變化；本課題為有氧運(yùn)動(dòng)在調(diào)節(jié)骨骼肌代謝相關(guān)基因及其在改善 IR中的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。
　　研究方法：

4、r>　　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用4周齡 C57BL/6雄性小鼠，經(jīng)過(guò)10周高脂飲食建立 IR小鼠模型，之后將小鼠分為正常飲食安靜組(NC)，正常飲食運(yùn)動(dòng)組(NE)，高脂飲食安靜組(HC)和高脂飲食運(yùn)動(dòng)組(HE)，運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行為期6周的有氧跑臺(tái)訓(xùn)練?？诜咸烟悄土吭囼?yàn)(OGTT)檢測(cè)小鼠葡萄糖耐量；提取血清，檢測(cè)空腹血清胰島素(FIN)及血脂水平；油紅 O染色檢測(cè)小鼠骨骼肌脂質(zhì)異位沉積；酶動(dòng)力學(xué)檢測(cè)小鼠骨骼肌檸檬酸合酶(CS)活性；Western

5、blot檢測(cè)小鼠骨骼肌 HDAC5，pHDAC5 Ser259，pHDAC5 Ser498，Ac-H3K9，AMPKα、pAMPKα Thr172，CPT1b蛋白表達(dá)水平；Real time PCR檢測(cè)小鼠骨骼肌CPT1b mRNA水平；分離小鼠骨骼肌胞漿胞核蛋白，檢測(cè)胞漿胞核中 HDAC5的蛋白含量；利用免疫共沉淀技術(shù)檢測(cè) HDAC5分別與14-3-3，MEF2A，AMPKα，pAMPKαThr172蛋白的結(jié)合；染色質(zhì)免疫共沉淀(CH

6、IP)分別檢測(cè)小鼠骨骼肌 MEF2A，HDAC5與CPT1b基因啟動(dòng)子的結(jié)合；構(gòu)建 MEF2A，HDAC5過(guò)表達(dá)質(zhì)粒及含有 CPT1b啟動(dòng)子的熒光素報(bào)告基因質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染C2C12細(xì)胞，分別檢測(cè) CPT1b mRNA表達(dá)水平及熒光素酶活性；利用 AMPK激動(dòng)劑 AICAR，AMPKα2及其顯性負(fù)突變 DN-AMPKα2腺病毒處理 C2C12肌管細(xì)胞，Western blot檢測(cè) HDAC5，pHDAC5 Ser259，pHDAC5 Ser4

7、98，AMPKα，pAMPKαThr172蛋白表達(dá)水平；野生型或 AMPKα2基因敲除小鼠分為安靜組和運(yùn)動(dòng)組，運(yùn)動(dòng)組小鼠進(jìn)行為期1小時(shí)的有氧跑臺(tái)訓(xùn)練，Western blot檢測(cè)小鼠骨骼肌 HDAC5，pHDAC5 Ser259，pHDAC5 Ser498，AMPKα1，AMPKα2，pAMPKαThr172，pCaMKII Thr286，pPKD Ser744/748蛋白表達(dá)水平。
　　研究結(jié)果：
　　(1)6周有氧跑臺(tái)訓(xùn)

8、練可以增加小鼠骨骼肌有氧氧化能力，降低由高脂飲食誘導(dǎo)的小鼠體重增加，改善受損的葡萄糖耐量，逆轉(zhuǎn)由高脂飲食引起的高胰島素血癥及脂質(zhì)代謝紊亂等癥狀，改善骨骼肌脂質(zhì)異位沉積；
　　(2)6周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練可以增加正常及 IR小鼠骨骼肌 pHDAC5 Ser259/498，pAMPKα Thr172位點(diǎn)磷酸化水平，促進(jìn)骨骼肌 HDAC5磷酸化依賴(lài)的出核效應(yīng)，減少 HDAC5與MEF2A的結(jié)合，增加 HDAC5與AMPK的結(jié)合，同時(shí)增加骨骼肌

9、 H3K9的乙?；剑黾庸趋兰?CPT1b mRNA和蛋白表達(dá)水平。(3)6周有氧跑臺(tái)訓(xùn)練可以增加正常及 IR小鼠骨骼肌 MEF2A與CPT1b基因啟動(dòng)子的結(jié)合，減少 HDAC5與CPT1b基因啟動(dòng)子的結(jié)合；在 C2C12肌管細(xì)胞中，HDAC5可抑制 MEF2A介導(dǎo)的CPT1b mRNA表達(dá)及含 CPT1b啟動(dòng)子熒光素酶活性的升高；AMPK的激動(dòng)劑 AICAR可以激活 AMPK-HDAC5信號(hào)通路，過(guò)表達(dá) AMPKα2及其顯性負(fù)突變

10、 DN-AMPKα2可分別激活或抑制AMPK-HDAC5信號(hào)通路；
　　(4)單次有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)可以激活野生型小鼠骨骼肌 AMPK-HDAC5信號(hào)通路；AMPKα2缺失狀態(tài)下，單次有氧運(yùn)動(dòng)對(duì)小鼠骨骼肌 HDAC5 Ser259/498磷酸化水平無(wú)顯著影響；AMPKα2缺失小鼠較野生型小鼠骨骼肌 HDAC5 Ser259/498磷酸化水平升高，其上游激酶 PKD Ser744/748磷酸化水平也顯著升高。
　　研究結(jié)論：

11、　　有氧運(yùn)動(dòng)可以有效改善由高脂飲食引起的小鼠糖脂代謝異常，這與運(yùn)動(dòng)介導(dǎo)的HDAC5的磷酸化出核效應(yīng)密切相關(guān)；HDAC5可以通過(guò) MEF2A抑制CPT1b基因轉(zhuǎn)錄活性，有氧運(yùn)動(dòng)可以調(diào)節(jié)骨骼肌 HDAC5/MEF2A與CPT1b啟動(dòng)子的相互作用，推測(cè)有氧運(yùn)動(dòng)可能通過(guò) HDAC5/MEF2A調(diào)節(jié) CPT1b的表達(dá)，從而改善骨骼肌脂質(zhì)異位沉積。有氧運(yùn)動(dòng)可以激活骨骼肌 AMPK-HDAC5信號(hào)通路，但 AMPK的缺失會(huì)阻斷運(yùn)動(dòng)增加骨骼肌 HDAC