抑癌基因PTEN在不同腫瘤細(xì)胞株的表達(dá)及其對(duì)CIK殺傷腫瘤細(xì)胞功能的影響.pdf

1、目的：
　　通過高分辨率熔解曲線（High Resolution Melt，HRM）法分析不同腫瘤細(xì)胞系抑癌基因PTEN的突變狀態(tài)，探討PTEN基因在不同腫瘤細(xì)胞中的突變頻率。運(yùn)用熒光定量PCR的方法檢測(cè)PTEN基因在各腫瘤細(xì)胞系中表達(dá)水平差異，轉(zhuǎn)染改變腫瘤細(xì)胞PTEN的相對(duì)表達(dá)水平探討其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、周期、遷移以及相關(guān)免疫分子的表達(dá)，并用鈣黃綠素法測(cè)定健康人CIK細(xì)胞對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的殺傷效率，分析不同PTEN相對(duì)表達(dá)水平對(duì)CI

2、K細(xì)胞殺傷效率的影響，為今后基于PTEN的腫瘤基因療法和CIK免疫療法提供一定的理論依據(jù)和參考。
　　方法：
　　一、不同腫瘤細(xì)胞系抑癌基因PTEN的突變研究
　　按照ATCC中相應(yīng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法，培養(yǎng)并收集各腫瘤細(xì)胞，基因組試劑盒法提取細(xì)胞基因組DNA，設(shè)計(jì)特異性突變篩選引物，運(yùn)用HRM分析方法篩選各腫瘤細(xì)胞PTEN基因突變的狀態(tài)，并進(jìn)一步測(cè)序驗(yàn)證HRM篩選結(jié)果，分析HRM法篩選腫瘤細(xì)胞PTEN基因突變的可行性與準(zhǔn)確

3、性，確定各不同腫瘤細(xì)胞抑癌基因PTEN的突變頻率。
　　二、熒光定量PCR法分析不同腫瘤細(xì)胞PTEN表達(dá)水平差異的研究
　　培養(yǎng)并收集各腫瘤細(xì)胞，提取各腫瘤細(xì)胞的總RNA，RT逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用SYBGreen染料熒光定量PCR法檢測(cè)各腫瘤細(xì)胞PTEN的表達(dá)水平，并比較分析不同腫瘤細(xì)胞PTEN表達(dá)水平的差異。
　　三、PTEN對(duì)腫瘤細(xì)胞生理特性的影響及其表達(dá)水平對(duì)免疫相關(guān)分子表達(dá)的影響
　　通過轉(zhuǎn)染的

4、方式改變腫瘤細(xì)胞PTEN的相對(duì)表達(dá)水平，探討PTEN表達(dá)變化對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移、周期的影響；運(yùn)用RT-PCR及瓊脂糖電泳半定量的方法分析腫瘤細(xì)胞PTEN轉(zhuǎn)染前后不同PTEN表達(dá)水平與P38MAPK，協(xié)同刺激分子CD80/86，B7-H1。B7-H4，以及趨化因子受體CCR6和CCR7表達(dá)水平之間的變化關(guān)系，為探討PTEN表達(dá)水平差異對(duì)CIK殺傷敏感性的影響奠定基礎(chǔ)。
　　四、健康人CIK細(xì)胞對(duì)不同腫瘤細(xì)胞殺傷效率差異及與不同腫瘤

5、細(xì)胞不同PTEN相對(duì)表達(dá)水平關(guān)系的研究
　　鈣黃綠素法測(cè)定健康人CIK細(xì)胞作用于各不同腫瘤靶細(xì)胞的殺傷效率，比較CIK細(xì)胞對(duì)不同腫瘤靶細(xì)胞殺傷效率的差異，并分析CIK細(xì)胞殺傷效率與腫瘤靶細(xì)胞
　　PTEN相對(duì)表達(dá)水平的相關(guān)性，真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-PTEN轉(zhuǎn)染HepG2和Hela腫瘤細(xì)胞，比較轉(zhuǎn)染前后CIK細(xì)胞對(duì)其殺傷效率變化，探討腫瘤靶細(xì)胞PTEN表達(dá)變化對(duì)CIK細(xì)胞對(duì)其殺傷敏感性的影響。
　　結(jié)果：

6、　　一、各腫瘤細(xì)胞系抑癌基因PTEN序列基本正常，較少發(fā)生突變。
　　利用HRM法篩選多種不同來源腫瘤細(xì)胞PTEN基因突變頻率，并且通過sanger法測(cè)序驗(yàn)證HRM篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幾乎所有腫瘤細(xì)胞PTEN基因均呈野生型表達(dá)，基因堿基序列與NCBI公布序列（GenBank:AH007803.1）完全一致，HRM篩選只發(fā)現(xiàn)Jurkat細(xì)胞系熔解曲線與其他細(xì)胞熔解曲線存在較明顯差異，通過TA克隆測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證了Jurkat細(xì)胞

7、系PTEN基因?yàn)椴糠謮A基增加突變，測(cè)序結(jié)果也證明了HRM篩選腫瘤細(xì)胞PTEN基因突變的可行性和準(zhǔn)確性。
　　二、各不同腫瘤細(xì)胞系PTEN相對(duì)表達(dá)水平存在差異。
　　提取各腫瘤細(xì)胞總RNA，Oligo（dT）逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，熒光定量PCR檢測(cè)各樣本PTEN mRNA轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同腫瘤細(xì)胞PTEN相對(duì)表達(dá)水平差異大小不一，部分存在較明顯差異，且與正常人PBMC相比均表達(dá)偏低，不同腫瘤細(xì)胞不同PTEN表達(dá)水平可以為研究

8、PTEN對(duì)腫瘤細(xì)胞生理活性及CIK對(duì)腫瘤細(xì)胞免疫反應(yīng)影響的不同提供基礎(chǔ)依據(jù)。
　　三、轉(zhuǎn)染提高腫瘤細(xì)胞PTEN相對(duì)表達(dá)水平可以抑制腫瘤細(xì)胞增值，阻滯周期運(yùn)轉(zhuǎn)，
　　減慢腫瘤細(xì)胞遷移修復(fù)速度，并且可以改變腫瘤細(xì)胞免疫相關(guān)分子的表達(dá)
　　轉(zhuǎn)染HepG2和Hela細(xì)胞使其過表達(dá)PTEN，MTT法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞活力變化，結(jié)果證明過表達(dá)PTEN可以降低腫瘤細(xì)胞增值活力，抑制腫瘤細(xì)胞增殖；PI染色法測(cè)定轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞周期變化，結(jié)果

9、說明PTEN可以使腫瘤細(xì)胞發(fā)生G0/G1到S期細(xì)胞周期阻滯；劃痕遷移修復(fù)法測(cè)定過表達(dá)PTEN對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移修復(fù)能力的變化，結(jié)果證明過表達(dá)PTEN可以削弱腫瘤細(xì)胞遷移修復(fù)能力。RT-PCR半定量法比較PTEN轉(zhuǎn)染前后HepG2和Hela細(xì)胞的PTEN相對(duì)表達(dá)水平與P38、CD80/86、B7H1、B7H4、CCR6、CCR7相對(duì)表達(dá)水平關(guān)系，結(jié)果證明PTEN表達(dá)水平不同可以影響P38、CD80/86、B7H1、B7H4、CCR6、CCR7

10、的表達(dá)變化，PTEN影響腫瘤細(xì)胞的生理特性及相關(guān)免疫分子表達(dá)為進(jìn)一步研究腫瘤細(xì)胞PTEN相對(duì)表達(dá)對(duì)CIK對(duì)其殺傷效率的影響提供理論依據(jù)。
　　四、健康人CIK對(duì)不同腫瘤靶細(xì)胞殺傷效率差異不同，并與腫瘤靶細(xì)胞自身PTEN相對(duì)表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)性
　　誘導(dǎo)成的健康人CIK細(xì)胞以不同腫瘤細(xì)胞為靶細(xì)胞，鈣黃綠素法測(cè)量殺傷效率差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康人CIK細(xì)胞對(duì)不同腫瘤靶細(xì)胞殺傷效率存在差異，并且相關(guān)性分析說明CIK細(xì)胞殺傷效率與腫瘤靶細(xì)胞

11、PTEN相對(duì)表達(dá)水平之間呈現(xiàn)出明顯負(fù)相關(guān)
　　（P<0.05），進(jìn)一步研究構(gòu)建重組表達(dá)體系pcDNA3.1-PTEN轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞改變PTEN相對(duì)表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)改變腫瘤靶細(xì)胞PTEN表達(dá)水平后CIK對(duì)其的殺傷效率出現(xiàn)了下調(diào)的趨勢(shì)。
　　結(jié)論：
　　成功建立HRM篩選腫瘤細(xì)胞PTEN基因突變的方法，鑒定了各腫瘤細(xì)胞PTEN基因的突變頻率和表達(dá)水平差異；證明了PTEN可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖，阻滯周期運(yùn)轉(zhuǎn)及削弱腫瘤細(xì)胞遷移修復(fù)，