海參硫酸多糖對營養(yǎng)過剩誘發(fā)的代謝疾病調(diào)控機制研究.pdf

1、代謝綜合征包括如肥胖、胰島素抗性、血糖不耐受、高血脂等一系列癥狀，這些癥狀進一步惡化會造成代謝疾病的發(fā)生，如二型糖尿病、非酒精性脂肪肝等。近幾年相關疾病致死率急速增長反映出環(huán)境和生活方式的改變，以高脂高糖為特征的現(xiàn)代社會飲食結構是促成代謝疾病高發(fā)的重要因素之一。因此，改善膳食結構，開發(fā)功能性食品成分，是預防和治療代謝疾病的有效手段。多糖作為一種天然來源的無毒大分子物質，具有很高的生物活性，在控制代謝疾病方面有著獨特的優(yōu)勢和功效。大多數(shù)多

2、糖來源于植物，結構復雜難以鑒定，質量不易控制。海參硫酸多糖因其結構的高度重復性及其所蘊藏的巨大生物活性潛力，引發(fā)廣大科研工作者的研究興趣。近年來，有越來越多的研究表明，海參硫酸多糖能夠調(diào)節(jié)機體能量代謝，緩解營養(yǎng)過剩帶來的一系列的代謝疾病。海參硫酸多糖的結構具有很強的特異性，其生物活性取決于結構特異性。然而關于海參硫酸多糖結構與治療代謝疾病之間的構效關系，目前還鮮有研究。
　　因此，本研究在前期研究基礎上，選取了四種具有特異性結構的

3、硫酸多糖作為研究對象，分別為美國肉參硫酸軟骨素（fCS-Ib）、美國肉參巖藻聚糖硫酸酯(fuc-Ib)、菲律賓刺參硫酸軟骨素(fCS-Pg)和菲律賓刺參巖藻聚糖硫酸酯(fuc-Pg)。其中，fCS-Ib、 fuc-Ib和fCS-Pg的一級結構已經(jīng)被解析，而fuc-Pg一級結構仍未知。本研究利用核磁、質譜等技術對fuc-Pg基本結構進行了進一步的解析。在已知四種海參硫酸多糖的基本結構基礎上，對它們的高級結構進行解析。從分子量、硫酸根取代方

4、式、空間結構等角度，在動物水平上研究了海參硫酸多糖結構對調(diào)節(jié)代謝疾病的功能活性的影響，并初步探究了其作用機制。主要研究內(nèi)容有:
　　(1)菲律賓刺參巖藻聚糖硫酸酯的一級結構解析
　　以菲律賓刺參巖藻聚糖為研究對象，采用溫和酸降解法制備寡糖，利用質譜結合核磁技術對其結構進行了解析。結果表明酸特異性作用于海參巖藻聚糖中非硫酸化巖藻糖（單元D）和第二個2，4-sulfated巖藻糖（單元A）。分離純化后得到一系列具有重復結構序列的

5、硫酸寡糖，二級質譜結果表明菲律賓刺參巖藻聚糖硫酸酯寡糖的結構符合[3Fuc(2S，4S)α1→3Fucα1→3Fuc(4S)α1→3Fucα1]n結構式。核磁共振結果進一步驗證了這一重復結構單元。本研究發(fā)現(xiàn)fuc-Pg是一種新型巖藻聚糖硫酸酯。
　　(2)四種海參硫酸多糖高級結構解析及其對營養(yǎng)過剩引發(fā)高血脂的調(diào)節(jié)作用
　　基于前期研究和第一章結果，四種海參硫酸多糖的一級結構目前已經(jīng)全部解析成功，但其高級結構即多糖鏈構象還未知

6、，因此本章運用原子力顯微鏡(AFM)和光散射技術(SEC-MALLS)，進一步解析了四種海參硫酸多糖高級結構。在此基礎上，對四種海參硫酸多糖的降血脂活性進行了研究。結果表明，多糖的側鏈和硫酸根取代位點影響硫酸多糖的高級結構，具有巖藻糖側鏈的fCS-Ib和fCS-Pg糖呈現(xiàn)無規(guī)則鏈狀，具有4-O-Sulfated取代的fuc-Pg也呈現(xiàn)無規(guī)則鏈狀結構，而以2-O-sulfated硫酸根取代為主的fuc-Ib則呈現(xiàn)球狀。此外，鏈構象的不同造

7、成了四種海參硫酸多糖的理化性質的不同，球狀構象的fuc-Ib相對于直鏈構象的fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg，粘度更高。高脂膳食是最常見的營養(yǎng)過剩的膳食方式，能夠造成肥胖、高血脂、炎癥、腸道菌群紊亂等一系列代謝疾病。將四種硫酸多糖應用于以高脂飼料誘導Sprague-Dawley(SD)大鼠模型中，結果表明，在相同劑量下，fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg相對于fuc-Ib具有更好的減肥、降血脂活性，能夠降低血清甘油三酯和總

8、膽固醇。fCS-Ib，fCS-Pg和fuc-Pg三種多糖中，fCS-Ib肝臟保護效果更佳。本研究表明硫酸根取代位點以及支鏈等一級結構會影響硫酸多糖在溶液中的高級結構，從而影響其降血脂活性。糖鏈在溶液中伸展開有利于硫酸多糖降血脂活性的發(fā)揮。
　　(3)美國肉參硫酸軟骨素及其寡糖對營養(yǎng)過剩引發(fā)的代謝疾病的影響
　　在前期實驗的基礎，本節(jié)選用降血脂、護肝效果最佳的美國肉參硫酸軟骨素為研究對象，探究其對營養(yǎng)過剩引發(fā)代謝疾病的調(diào)控機制

9、，從分子量角度研究了構效關系。以高脂高糖膳食喂養(yǎng)C57BL/6小鼠為模型，分別灌胃相同劑量的美國肉參硫酸軟骨素和寡糖（DfCS-Ib）。結果表明，fCS-Ib及其降解產(chǎn)物都能夠有效的抑制高脂膳食帶來的代謝紊亂。在不影響攝食量的基礎上，fCS-Ib和DfCS-Ib能夠減少體重、肝臟、腎臟、脂肪組織的增加，降低血清中甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、葡萄糖(Glucose)、腫瘤壞死因子(TNF-α)和白介素6

10、(IL-6)的含量，提高血清中高密度脂蛋白(HDL-C)的水平。同時，fCS-Ib和DfCS-Ib能夠維持肝臟組織的正常形態(tài)，減少脂肪組織細胞肥大。此外，fCS-Ib和DfCS-Ib能夠調(diào)節(jié)由營養(yǎng)過剩引起的脂肪組織中PPARγ，lcptin，aP2和F4/80的表達異常，維護脂肪組織的正常功能，促進脂肪因子的正常分泌，緩解高脂膳食引發(fā)的炎癥。本節(jié)證明美國肉參硫酸軟骨素及其寡糖能夠緩解膳食引發(fā)的肥胖、高血脂、高血糖、炎癥等代謝疾病。然而二

11、者的作用靶向還不明確，有待于進一步研究。
　　(4)美國肉參硫酸軟骨素及其寡糖對營養(yǎng)過剩引發(fā)腸道菌群紊亂的影響
　　多糖一直被認為是一種膳食纖維，有利于腸道菌群的生長，本節(jié)利用16SrDNA技術，探究了美國肉參硫酸軟骨素及其寡糖對腸道菌群的影響，以驗證二者的作用靶向目標。結果表明，本實驗條件下的高脂膳食對腸道菌群的豐富度和多樣性無明顯影響，fCS-Ib和DfCS-Ib對腸道菌群的多樣性無明顯影響，但二者均能夠提高腸道微生物豐

12、富度。高脂膳食會改變糞便中微生物的種類和組成，造成腸道內(nèi)的微生物菌群紊亂。fCS-Ib和DfCS-Ib則能夠不同程度的緩解腸道菌群紊亂，提高有益菌Barnesiella的比例。相對于DfCS-Ib，大分子的fCS-Ib能夠更有效的改善高脂膳食造成的腸道菌群紊亂，降低Firmicutes的豐度，提高Bacteroidetes的豐度，使二者的組成和比例更接近于正常組。DfCS-Ib能夠改善高脂小鼠中Bacteroidetes門中有益菌的組成

13、，但DfCS-Ib組中Erysipelotrichaceae豐度非常高，這一類型的微生物屬于Firmicutes門，其對宿主的影響還有待確定。
　　(5)美國肉參硫酸軟骨素及其寡糖對營養(yǎng)過剩引發(fā)肝臟代謝紊亂的影響
　　營養(yǎng)過剩會引發(fā)肝臟代謝紊亂，從而造成機體能量不能正常代謝。本章運用轉錄組高通量測序手段檢測美國肉參硫酸軟骨素及其降解產(chǎn)物對營養(yǎng)過剩引發(fā)肝臟代謝紊亂的影響。相對于對照組，高脂組造成了不同代謝通路紊亂，尤其是糖脂代

14、謝通路。fCS-Ib和DfCS-Ib則能夠不同程度的緩解肝臟代謝紊亂。fCS-Ib和DfCS-Ib能夠下調(diào)與脂質生成相關基因的表達，如Fasn，Acsl3，Acsl5，Elovl3，Elovl6，Scd1 and Scd2，同時上調(diào)與β氧化相關基因的表達，維持肝臟組織正常的生理代謝功能。與微生物結果不同的是，相對于fCS-Ib，小分子的DfCS-Ib能夠更有效的改善高脂膳食造成的肝臟代謝紊亂，使其相關基因表達更接近于正常組。Rt-PCR