瘦素對兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷修復的作用.pdf

1、目的：通過軟骨細胞海藻酸鈣支架共培養(yǎng)，觀察軟骨細胞在支架材料上的生物行為。將支架植入兔膝關(guān)節(jié)軟骨缺損模型，定期膝關(guān)節(jié)局部注射10ng/ml的瘦素，觀察、缺損處的修復狀況，進而探討瘦素對兔膝關(guān)節(jié)軟骨損傷是否具有一定的修復作用。
　　方法：1.軟骨細胞分離與培養(yǎng)：2只健康4周齡新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨，將軟骨細胞分離及擴增、傳代。光鏡下軟骨細胞呈星形、多角形，鋪路石樣生長，HE染色觀察軟骨細胞形態(tài)，免疫組化染色觀察Ⅱ型膠原分泌情況。2.海藻

2、酸鈉與氯化鈣混合后得到的三維支架，將傳代的軟骨細胞培養(yǎng)于其中。顯微鏡下觀察細胞生長增殖狀況，并做HE染色及免疫組化染色。3.用成年新西蘭大白兔制備兔膝關(guān)節(jié)缺損模型。4.將實驗動物隨機分為3組：對照組：每5日經(jīng)兔膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射1ml生理氯化鈉；支架組：經(jīng)兔膝關(guān)節(jié)缺損腔內(nèi)植入修整好的含有軟骨細胞的三維支架，并每5日注射生理氯化鈉1ml；實驗組：三維支架植入后，每5日局部注射1ml的10ng/ml瘦素。實驗中注意隨機分組，實驗個體缺損部位相同

3、，分別于術(shù)后12周處死取材，觀察缺損區(qū)軟骨生長修復情況，并用HE染色、Masson染色、免疫組化染色及PCR定量分析檢驗修復情況。以評價瘦素對三維支架植入對軟骨缺損的修復作用。
　　結(jié)果：1.分離下來的軟骨細胞呈圓形或橢圓形，經(jīng)24小時后逐漸貼壁，72小時后大部分已經(jīng)貼壁。2.傳代后的軟骨細胞HE染色鏡下觀察呈三角形、多角形或梭形，細胞核明顯，呈圓形或橢圓形，HE染色顯示軟骨細胞形態(tài)良好。免疫組化染色觀察結(jié)果見細胞及基質(zhì)呈棕黃色，

4、細胞密集處顏色較深，表現(xiàn)出其特有活性。3.將混懸的軟骨細胞、海藻酸鈉、氯化鈣混合，制備出了三維支架，支架內(nèi)培養(yǎng)的細胞未見明顯的凋亡與裂解，且細胞活性良好，HE及免疫組化檢查結(jié)果說明三維培養(yǎng)的細胞適合植入。4.植入關(guān)節(jié)腔內(nèi)后，未見明顯炎癥反應(yīng)及免疫排斥反應(yīng)，支架軟硬適宜，不會損傷關(guān)節(jié)軟骨，且后期材料降解完全，無關(guān)節(jié)殘留，表現(xiàn)出良好的組織相容性。5.植入修整后的三維支架并每日注射瘦素，促進了Ⅱ型膠原及IGF-1的生成，對缺損處的修復有明顯促

5、進作用。6.實驗組：膝關(guān)節(jié)缺損處表面平整較光滑，與其他兩組相比，PCR擴增實驗檢測IGF-1分泌明顯高于其他兩組，差異具有統(tǒng)計學意義；對照組：缺損處未見明顯修復，膝關(guān)節(jié)粘連、關(guān)節(jié)軟骨破壞較重，可見明顯骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)；支架組：缺損處軟骨較光滑，但低于實驗組，膝關(guān)節(jié)未見骨性關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)。7.組織病理學檢查顯示，實驗組纖維及瘢痕組織較少，Ⅱ型膠原染色顯示數(shù)量高于其他兩組，HE染色顯示少量成纖維細胞，核較小，排列相對規(guī)則。對照組纖維組織多，排列紊

6、亂，軟骨細胞少，核大，排列不規(guī)律。支架組軟骨細胞細胞核、成纖維細胞數(shù)量及結(jié)構(gòu)介于兩者之間。
　　結(jié)論:1.藻酸鈣支架與軟骨細胞共培養(yǎng)，軟骨細胞可以很好的在支架材料的表面和內(nèi)部黏附、生長及增殖，細胞活性良好，未見明顯細胞毒性。2.實驗過程中藻酸鈣支架材料在兔體內(nèi)引起的炎癥反應(yīng)輕微，血管化良好，材料降解吸收緩慢，具有良好的組織相容性。3.本實驗條件下10ng/ml的瘦素，可促進軟骨細胞增殖、Ⅱ型膠原及IGF-1的分泌，局部定期注射可促