不同年齡組食蟹猴骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖分化特性研究.pdf

1、自1976年Friedenstein等首次分離骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，MSCs)以來，因其取材方便，可在體外培養(yǎng)擴(kuò)增，具有多向分化潛能等優(yōu)點(diǎn)而備受關(guān)注。MSCs能夠分化成為中胚層的各種組織細(xì)胞，包括骨骼、軟骨、脂肪、肌肉和肌腱等，因此，它是組織工程重要的種子細(xì)胞之一。這些可用于臨床移植的MSCs先從供者體內(nèi)分離出來，在體外大量擴(kuò)增，能夠被冷凍保存而其細(xì)胞核型和分化能力并不改變

2、。然而，在骨髓中的MSCs含量極少，每104-105個(gè)單個(gè)核細(xì)胞中只有一個(gè)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞，如此微量的MSC顯然難以滿足組織工程的需要。一些研究還表明，人類MSCs在體外培養(yǎng)過程中其增殖能力和成骨分化能力會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加而逐漸減弱。因此，建立一套適合科學(xué)研究和臨床應(yīng)用的骨髓問質(zhì)干細(xì)胞的分離、擴(kuò)增的方法就顯得非常重要。 在解決了體外MSCs移植過程中所需細(xì)胞數(shù)量不足的問題之后，人體臨床試驗(yàn)所面臨的最大難題將會(huì)是動(dòng)物試驗(yàn)的遺傳背景

3、差異問題。與人類遺傳特性接近的動(dòng)物試驗(yàn)更加具有說服力，建立人類疾病的靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型，進(jìn)而對(duì)干細(xì)胞與組織工程產(chǎn)品的安全性和有效性進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)于建立干細(xì)胞的治療模式和治療劑量，保證干細(xì)胞臨床應(yīng)用的安全性具有重要的意義。因此，在人體臨床試驗(yàn)應(yīng)用之前，MSCs輸注的安全性以及細(xì)胞在人體內(nèi)的分布等均應(yīng)在高等哺乳動(dòng)物中被充分的評(píng)價(jià)，例如非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物，它們的遺傳特性更加接近于人類。已經(jīng)有很多研究發(fā)現(xiàn)，恒河猴MSCs的生物學(xué)特性與人類MSCs相類似，

4、他們認(rèn)為，恒河猴可以作為一類測(cè)試MSCs在體內(nèi)輸注、分化能力、毒性和安全性的合適模型。另外一種非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物食蟹猴也已經(jīng)開始用于各類醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)，研究食蟹猴MSCs增殖分化特征，可以更好的為研究人類骨髓間質(zhì)干細(xì)胞提供幫助，最終為問質(zhì)干細(xì)胞用于臨床治療疾病奠定基礎(chǔ)。由于MSCs在細(xì)胞再生和組織工程應(yīng)用中的巨大潛力，許多研究者都想加快MSCs治療臨床疾病的進(jìn)程，然而，MSCs在體外培養(yǎng)會(huì)經(jīng)歷幾個(gè)不同的生長(zhǎng)階段，有些會(huì)因最終老化而凋亡，這些可能與

5、供者的年齡存在一定的相關(guān)性。因此，MSCs移植大量用于臨床之前，其供者年齡的篩選是很重要的。另外，隨著年齡的增加，體內(nèi)骨組織的數(shù)量會(huì)逐漸減少，這有可能是成骨數(shù)量的減少，有可能足骨質(zhì)吸收的增加，也有可能是兩方而共同作用的原因。眾所周知，骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞在骨髓中有著共同的祖細(xì)胞，即骨髓問質(zhì)干細(xì)胞。于是，有學(xué)者開始關(guān)注MSCs成骨和成脂能力之間的關(guān)系，已經(jīng)有研究表明，這種與年齡相關(guān)性的成骨的減少正是由于MSCs成脂能力的增加所導(dǎo)致，即MSCs

6、的成骨分化能力和成脂分化能力存在著一種平衡，他們認(rèn)為，在供者不同的年齡階段，MSCs的成骨能力和成脂能力是成反比的。目前，還沒有學(xué)者能夠針對(duì)這些問題給出比較明確的解釋。 基于上述原因，本實(shí)驗(yàn)以食蟹猴為對(duì)象，研究骨髓間質(zhì)干細(xì)胞增殖分化特性，包括以下兩個(gè)部分： 1、分離培養(yǎng)MSCs，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 2、將所采集的食蟹猴MSCs依據(jù)供者年齡不同進(jìn)行分組，比較不同組MSCs增殖分化潛能，主要的指標(biāo)包括形態(tài)特征

7、，生長(zhǎng)曲線，克隆形成能力，細(xì)胞表面標(biāo)記的表達(dá)，成骨成脂分化能力等。 方法： 1、氯胺酮肌注麻醉健康食蟹猴后置于手術(shù)臺(tái)上，脛骨上端穿刺抽得抗凝骨髓后密度梯度離心分離獲得MSCs，用貼壁培養(yǎng)的方法進(jìn)行體外擴(kuò)增，流式細(xì)胞儀檢測(cè)MSCs表面CD分子的表達(dá)情況。將長(zhǎng)勢(shì)較好的細(xì)胞傳入六孔板，分別加入成骨成脂誘導(dǎo)液體外定向誘導(dǎo)MSCs向這兩個(gè)方向分化，14天后分別進(jìn)行特異性的茜素紅和油紅O染色，鏡下觀察誘導(dǎo)情況，并與對(duì)照組比較。

8、 2、將所分離的食蟹猴MSCs依據(jù)供體年齡的不同分為三組(少年組、青壯年組和老年組)，顯微鏡下觀察每一組細(xì)胞的形態(tài)特征，繪制不同組細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線，分析克隆形成能力，流式細(xì)胞檢測(cè)各組MSCs表面標(biāo)記的表達(dá)，相同代數(shù)不同組的細(xì)胞在同等條件下進(jìn)行成骨成脂誘導(dǎo)，將每組的結(jié)果作一比較。 結(jié)果： 1、MSCs的分離、體外擴(kuò)增、生物學(xué)特性鑒定 Ficoll-Hypaque分離液分離到的單個(gè)核細(xì)胞24小時(shí)貼壁，3天后可見梭形細(xì)

9、胞。達(dá)80％融合后胰酶消化傳代，可在含抗病毒藥物10nM Tenofovir的低糖DMEM完傘培養(yǎng)液中傳代擴(kuò)增。流式細(xì)胞檢測(cè)MSCs表面CD34、CD45等表達(dá)為陰性， CD29、CD105、CD44、CD166等表達(dá)為陽(yáng)性，證明本實(shí)驗(yàn)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞是骨髓問質(zhì)干細(xì)胞。成骨誘導(dǎo)兩周后，用茜素紅進(jìn)行染色，可見橘紅色的鈣結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)兩周后，進(jìn)行油紅O染色，可見橙紅色的脂滴。說明MSCs在體外具備誘導(dǎo)成骨和成脂的能力。 2、不同年齡

10、組MSCs增殖分化潛能的比較 食蟹猴MSCs的細(xì)胞增殖能力與其供者的年齡有一定的相關(guān)性，少年組的細(xì)胞延滯期約4天，青壯年組和老年組區(qū)別不明顯，約為5天。少年組的絀胞倍增時(shí)間最短，平均為50小時(shí)，而青壯年組和老年組分別為72小時(shí)和85小時(shí)。隨著年齡的增長(zhǎng)，骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的克隆形成能力也逐漸減弱。然而，MSCs表面標(biāo)記CD分子的表達(dá)穩(wěn)定，與供者年齡沒有顯示出明顯的相關(guān)性。 來自不同年齡組的MSCs在同等條件下成骨誘導(dǎo)，14天

11、后只有少年組MSCs比對(duì)照組有了明顯的改變，青壯年組和老年組均不明顯，茜素紅染色后更加證實(shí)了這個(gè)結(jié)果。來自不同年齡組的MSCs在同等條件下成脂誘導(dǎo)，3天后各個(gè)組的差別并小明顯，而7天后少年組可見到大量的脂滴，片狀分布，而老年組仍然只有少量散在分布的脂滴，青壯年組則介于二者之間。誘導(dǎo)第14天后油紅0染色鏡下觀察，少年組的脂滴數(shù)量大約占到整個(gè)視野的70％，而老年組僅有10％左右。半定量法測(cè)油紅0在510nm處OD值顯示了同樣的結(jié)論，少年組平

12、均為0.51，明顯大于老年組的0.23，青壯年組仍然是介于二者之間，為0.38，三個(gè)組所得到的OD值有顯著性差異，P<0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)論： 1、成功利用淋巴細(xì)胞分離液密度梯度離心的方法進(jìn)行了食蟹猴骨髓來源的MSCs的分離、培養(yǎng)及擴(kuò)增。形態(tài)學(xué)，細(xì)胞表面標(biāo)記，多向分化潛能的實(shí)驗(yàn)表明，所分離培養(yǎng)的細(xì)胞群確實(shí)是具有自我更新和多向分化潛能的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞。 2、對(duì)比觀察少年組、青壯年組和老年組MSCs增殖能力