MSM人群HIV相關(guān)認(rèn)知功能障礙的臨床特征及其相關(guān)單核細(xì)胞表面趨化因子受體研究.pdf

1、目的：
　　HIV能夠侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nerve system，CNS)，造成HIV相關(guān)神經(jīng)認(rèn)知功能障礙（HIV-associated neurocognitive disorders，HAND），嚴(yán)重影響患者工作學(xué)習(xí)能力及生活質(zhì)量?？狗崔D(zhuǎn)錄病毒治療(Antiretroviral treatment，ART)是目前唯一能夠控制病毒血癥、延長患者壽命的治療方法。隨著HIV患者生存期的延長，ART時代HAND患病人數(shù)

2、將越來越多，早期發(fā)現(xiàn)并干預(yù)可延緩疾病進展，提高患者個體生活質(zhì)量，減輕社會負(fù)擔(dān)。
　　男男同性性傳播已成為我國上升速度增長最快的HIV傳播途徑，男男同性戀(men who have sex with men，MSM)具有獨特的行為及心理學(xué)特征，其中一些可能與認(rèn)知功能相關(guān)（如抑郁狀態(tài)），因此HIV感染MSM的認(rèn)知功能值得關(guān)注。由于認(rèn)知功能受地域、文化影響，目前不同國家報道的MSM人群HAND發(fā)生率差異較大，我國尚無針對MSM人群HAN

3、D發(fā)生情況及臨床特征的研究。
　　HIV不能直接進入CNS，但能通過感染外周血單核細(xì)胞滲透穿過血腦屏障。單核細(xì)胞進入CNS后成熟活化，衍生成為巨噬細(xì)胞，分泌釋放具有神經(jīng)毒性的病毒顆粒和免疫炎性因子，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。HIV腦病患者尸檢結(jié)果顯示，CNS中存在大量活化的巨噬細(xì)胞，因此單核/巨噬細(xì)胞是HAND最重要的致病媒介。
　　趨化因子是在單核細(xì)胞跨血腦屏障過程中起到重要促進作用的一組低分子蛋白。目前已有研究顯示HAND患者

4、外周血、腦脊液和腦組織中多種趨化因子(CCL2、IL8等)明顯升高。趨化因子可能作用于多種細(xì)胞、多種趨化因子受體，找到關(guān)鍵單核細(xì)胞表面趨化因子受體有助于明確HAND特異性標(biāo)志物、了解HAND致病機制。然而，目前對單核細(xì)胞趨化因子受體表達情況的報道很少，有限的報道顯示HAND患者單核細(xì)胞及其亞群CCR2的表達可能與HAND發(fā)病相關(guān)，但此研究的研究對象包含治療和未治療患者，ART治療已經(jīng)被認(rèn)為是CCR2及其他趨化因子受體表達水平的干擾因素，

5、尚缺乏更具說服力的ART治療后HAND相關(guān)趨化因子受體表達及致病機制的研究。
　　本研究以中國MSM人群HIV感染者和HIV陰性健康人隊列為基礎(chǔ)，擬通過規(guī)范化的認(rèn)知功能評價體系，以同地區(qū)年齡、文化程度匹配的健康MSM作為參照，對HIV感MSM的認(rèn)知功能進行評價，分析該人群HAND的臨床特征，明確ART時代HAND的關(guān)鍵單核細(xì)胞亞群，尋找其表面與致病相關(guān)的重要趨化因子受體，并初步闡述其在HAND致病機制中的作用，為解析HAND致病機

6、制、探索ART以外HAND神經(jīng)保護策略提供線索。
　　方法：
　　1.研究對象
　　(1) HAND臨床特征研究:從門診分別納入HIV感染MSM84例，及年齡和文化程度匹配的HIV陰性健康MSM對照30例。
　　(2)治療、治療時機對單核細(xì)胞表面趨化因子受體影響研究:納入71例HIV感染MSM，包括急性期未治療患者(PHI-nART)3例、急性期治療患者（PHI-nART）21例、慢性期未治療患者(CHI-nAR

7、T)14例和慢性期治療患者(CHI-ART)33例;納入12例健康(NC) MSM。
　　(3)單核細(xì)胞及其亞群表面趨化因子受體與HAND相關(guān)性研究:從進行過認(rèn)知功能測試的HIV感染MSM中篩選出年齡、文化程度匹配的慢性期經(jīng)ART至少半年患者，包括HAND者（17例）和non-HAND者（12例）。
　　(4)原代單核細(xì)胞:經(jīng)治療病毒血癥抑制患者10例用于跨膜遷移實驗，慢性期未治療患者7例用于單核細(xì)胞亞群HIVDNA含量差異

8、實驗。
　　(5)細(xì)胞系:人臍靜脈血內(nèi)皮細(xì)胞用于跨膜遷移實驗，人THP-1細(xì)胞用于巨噬細(xì)胞極化實驗。
　　2.HAND的診斷及分類
　　(1) HAND診斷:根據(jù)Frascati標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)知功能成套量表包含6個認(rèn)知領(lǐng)域（言語流利度、注意力/工作記憶、抽象/執(zhí)行能力、學(xué)習(xí)記憶、信息處理速度、運動能力），每個領(lǐng)域2個量表。用低于均值至少1個SD評價單個認(rèn)知領(lǐng)域受損，HAND診斷要求至少2個認(rèn)知領(lǐng)域受損。合并HIV以外明確原因

9、的認(rèn)知功能障礙、酗酒、使用毒品或其他認(rèn)知功能損害藥物、重癥抑郁癥發(fā)作期的患者將被排除。
　　(2) HAND分類:根據(jù)Frascati標(biāo)準(zhǔn)，量表得分低于1個SD、至少2個認(rèn)知領(lǐng)域受累、無日常生活能力受損被定義為無癥狀神經(jīng)認(rèn)知障礙(asymptomaticneurocognitive impairment，ANI);認(rèn)知功能量表得分低于1個SD、至少2個認(rèn)知領(lǐng)域受累、合并日常生活能力受損被定義為輕度神經(jīng)認(rèn)知功能障礙(mildneur

10、ocognitive impairment，MNI);認(rèn)知功能量表得分低于2個SD、至少2個認(rèn)知領(lǐng)域受累、日常生活能力明顯受損被定義為HIV相關(guān)癡呆(HIV-associated dementia，HAD)。
　　3.外周血單核細(xì)胞亞群檢測
　　分離外周血PBMC，流式細(xì)胞儀上圈出單核細(xì)胞，并根據(jù)CD14、CD16的表達進一步分成三個亞群:經(jīng)典單核細(xì)胞(CD14+CD16-)、中間型單核細(xì)胞(CD14+CD16+)、非經(jīng)典單

11、核細(xì)胞(CD14lowCD16+)。
　　4.單核細(xì)胞表面標(biāo)志物及趨化受體的檢測
　　分離外周血PBMC，用流式染料CD14、CD16、CCR2、CX3CR1、CXCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CD163、CCR7、CD200R避光染色，在LSRⅡ流式細(xì)胞儀上機檢測。
　　用樣品染色管染料平均熒光強度(MFI)與陰性對照管該通道平均熒光強度(MFI)的比值，即MFI ratio來評價來各樣本的單核細(xì)胞表面趨

12、化因子受體的表達水平。
　　5.單核細(xì)胞及其亞群跨膜遷移實驗
　　將2.5×104個臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞種入3μm孔徑的transwell小室上層，培養(yǎng)3天;第4天在transwell下室中分別加入IL8(300ng/ml)或不加IL8作為對照，37℃孵育1小時。試劑盒陰選出單核細(xì)胞（包含CD14+CD16-和CD14+CD16+兩個亞群），加到transwell上室約1×106個/孔;24小時后用冰PBS吹打沖洗三次，收下室細(xì)胞

13、，流式染色CD14和CD16，加入含等量BD計數(shù)微球的PBS300μl混勻后上機。
　　6.巨噬細(xì)胞極化實驗
　　(1)THP-1來源巨噬細(xì)胞的極化:將THP-1細(xì)胞接種到48孔板中，加入50ng/mlPMA孵育6小時，設(shè)置不同實驗組繼續(xù)孵育66小時:M1、M2、IL8、對照、M1+IL8、M2+IL8。
　　(2)實時定量PCR法檢測巨噬細(xì)胞極化標(biāo)志物:
　　用QIAGEN試劑盒提取各孔巨噬細(xì)胞mRNA，當(dāng)天將

14、mRNA轉(zhuǎn)錄為cDNA，Roche480上進行目的基因CD200R、CD206、CD80、TNF-α和內(nèi)參基因GAPDH的相對定量檢測。采用相對定量法（2-△△Ct法）計算各種刺激下巨噬細(xì)胞各目的基因的mRNA相對表達量。
　　7.單核細(xì)胞亞群HIVDNA含量差異實驗
　　(1)單核細(xì)胞亞群分選:
　　從50ml新鮮血中分離PBMC，用試劑盒陰選單核細(xì)胞，加入CD14、CD16染料各10μl，Aria流式細(xì)胞儀上機分選

15、兩路單核細(xì)胞:CD14+CD16-和CD14+CD16+，模式為Purity，分選出的兩路細(xì)胞純度均＞90％。
　　(2)實時定量PCR法檢測單核細(xì)胞HIVDNA:
　　用QIAGEN試劑盒提取單核細(xì)胞兩個亞群的全基因組DNA，配制引物和探針，用NL43質(zhì)粒做標(biāo)準(zhǔn)曲線，Roche480上進行HIVDNA的絕對定量檢測。
　　8.統(tǒng)計學(xué)分析方法
　　所有數(shù)據(jù)采用SPSS18.軟件分析，連續(xù)變量用均值和標(biāo)準(zhǔn)差(sta

16、ndard deviation，SD)表示。連續(xù)變量符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用t檢驗進行比較;不符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用Mann-Whitney U檢驗進行比較。同一研究對象的不同細(xì)胞間比較采用非參數(shù)配對Wilcoxon符號秩檢驗。Spearman相關(guān)性分析用于分析各認(rèn)知領(lǐng)域異常與HAND與否/嚴(yán)重程度見的關(guān)系。HAND相關(guān)臨床因素用logistic單因素和多因素回歸分析進行。統(tǒng)計概率采用雙側(cè)檢驗，p＜0.0.5為統(tǒng)計學(xué)有差異。
　　結(jié)

17、果：
　　1.HAND患者26例（約占31.0％），其中ANI、MNI、HAD分別9例(10.7％)、14例(16.7％)和3例(3.6％)。ANI和MNI占所有HAND的88.5％。
　　2.所有認(rèn)知領(lǐng)域異常均與HAND明顯相關(guān)（所有p＜0.05），執(zhí)行功能和運動功能異常與HAND嚴(yán)重程度明顯相關(guān)（所有p＜0.05）。
　　3.單因素回歸分析發(fā)現(xiàn)年齡、文化程度、最低CD4+T細(xì)胞數(shù)和急性期治療與HAND明顯相關(guān)（所有

18、p＜0.05）。
　　4.急性期治療與最低CD4+T細(xì)胞數(shù)存在關(guān)聯(lián)，分別將最低CD4+T細(xì)胞數(shù)、急性期治療這兩個因素與年齡和文化程度做多因素回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)最低CD4+T細(xì)胞數(shù)低是HAND的獨立危險因素(p=0.036)，而急性期治療與HAND無明顯相關(guān)性(p=0.192)。
　　5.抗病毒治療及治療時機對單核細(xì)胞表面趨化因子受體的影響
　　治療PHI單核細(xì)胞CCR2表達高于未治療PHI(p=0.05);治療PHI單

19、核細(xì)胞CXCR2表達明顯高于未治療PHI(p=0.03)，治療CHI單核細(xì)胞CXCR2表達明顯高于未治療CHI(p＜0.001)。
　　6.慢性期經(jīng)治療患者的HAND相關(guān)單核細(xì)胞亞群
　　HAND患者CD14+CD16+亞群百分比明顯高于non-HAND患者(p＜0.05)，而兩組人其他兩個亞群百分比未見明顯差異（所有p＞0.05）
　　7.慢性期經(jīng)治療患者單核細(xì)胞及其各亞群趨化因子受體表達與HAND的相關(guān)性分析

20、>　　(1) HAND患者單核細(xì)胞表面CXCR1、CCR2表達明顯高于non-HAND患者（所有p值均＜0.05），HAND患者單核細(xì)胞表面CX3CR1表達有高于non-HAND患者的趨勢（p值為0.054），而HAND患者單核細(xì)胞表面CXCR2表達明顯低于non-HAND患者（p值＜0.05）。
　　(2) HAND患者單核細(xì)胞CD14+CD16-亞群表面CXCR1、CX3CR1表達明顯高于non-HAND患者（所有p值均＜0.

21、05），HAND患者單核細(xì)胞CD14+CD16-亞群表面CCR2表達有高于non-HAND患者的趨勢（p值為0.069），而HAND患者單核細(xì)胞CD14+CD16-亞群表面CXCR2表達明顯低于non-HAND患者（p值＜0.05）。
　　(3) HAND患者單核細(xì)胞CD14+CD16+亞群表面CXCR1表達明顯高于non-HAND患者（p值為0.008）。
　　(4) HAND患者單核細(xì)胞CD14lowCD16+亞群表面C

22、CR5、CD200R表達明顯高于non-HAND患者（所有p值均＜0.05），HAND患者單核細(xì)胞CD14lowCD16+亞群表面CXCR1和CXCR2表達均有有高于non-HAND患者的趨勢（p值分別為0.061和0.065）。
　　8.CXCR1在不同細(xì)胞及細(xì)胞亞群中的表達差異
　　CXCR1在單核細(xì)胞CD14+CD16+和CD14lowCD16+亞群表達明顯高過CD14+CD16-亞群（所有p值均＜0.001）。

23、>　　9.單核細(xì)胞及其亞群跨膜遷移實驗
　　(1)IL8/對照組單核細(xì)胞跨膜遷移數(shù)量比較
　　我們將分選出的HIV感染者單核細(xì)胞置入提前鋪板人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的tranwell上室，下室放入含IL8或不含IL8的DMEM，孵育24小時。收下室細(xì)胞，將IL8組和對照組的下室細(xì)胞染色后分別加入等量微球，比較兩組細(xì)胞/微球比值差異。對比IL8及對照組遷移數(shù)量，發(fā)現(xiàn)IL8組遷移到tranwell下室的細(xì)胞數(shù)明顯高于對照組(p=0.02

24、4)。
　　(2)單核細(xì)胞各亞群跨膜遷移比較
　　單核細(xì)胞雖然在跨膜前分三群，但流式圖顯示遷移24小時tranwell小室下層單核細(xì)胞主要有兩群:CD14+CD16+和CD14+CD16-。我們以跨膜后兩群細(xì)胞的百分比比值來評價IL8/對照組中兩群的跨膜遷移效率，結(jié)果顯示無論IL8組還是對照組CD14+CD16+％/CD14+CD16-％在跨膜后明顯高過跨膜前（所有p＜0.05）。
　　10.IL8對巨噬細(xì)胞極化影響實

25、驗
　　從細(xì)胞形態(tài)上看，IL8刺激下巨噬細(xì)胞呈圓形或橢圓形，無偽足，類似M1型巨噬細(xì)胞。
　　用實時定量PCR法對各種刺激孔/對照孔目的基因(CD200R、CD206、CD80和TNF-α) mRNA進行相對定量。
　　IL8刺激的巨噬細(xì)胞CD200R、CD206明顯低于M2型巨噬細(xì)胞（所有p＜0.05），而與M1巨噬細(xì)胞無明顯差異（所有p＞0.05）;M2+ IL8組CD206明顯高于IL8(p=0.014)。

26、>　　IL8刺激的巨噬細(xì)胞CD80與M1、M2型巨噬細(xì)胞均無明顯差異（所有p＞0.05），M1+IL8的CD80明顯低于M1型巨噬細(xì)胞(p＜0.05); IL8刺激的巨噬細(xì)胞TNF-α明顯低于M1巨噬細(xì)胞(p=0.02)。
　　11.單核細(xì)胞亞群HIVDNA含量差異研究
　　用實時定量PCR法對單核細(xì)胞兩個主要亞群的HIVDNA含量進行定量檢測。結(jié)果顯示CD14+CD16+的HIVDNA含量明顯高于CD14+CD16-(p=

27、0.03)。
　　結(jié)論：
　　1.中國人MSM人群HAND的發(fā)生頻率約為31％，其中輕型HAND(ANI和MNI)占88.5％;精細(xì)運動能力、言語流利度、學(xué)習(xí)記憶、工作記憶、信息處理速度和執(zhí)行能力異常均提示患者可能合并HAND，執(zhí)行能力和運動功能異常提示HAND嚴(yán)重程度可能較重。
　　2.CD14+CD16+亞群是HAND相關(guān)單核細(xì)胞亞群;CXCR1在HAND患者單核細(xì)胞及各亞群高表達，是HAND相關(guān)單核細(xì)胞表面趨化因