兩種酶的人工基因在酵母中的表達(dá)及改造植酸酶的新策略.pdf

1、本文通過改造Anp與Lip1的編碼基因以實現(xiàn)它們在畢赤酵母(Pichiapastoris)中的高效表達(dá).首先將Anp的編碼基因中114個宿主P.pastoris不偏愛的密碼子替換為偏愛密碼子.其中主要替換的是編碼S、R、T、G、P、L等氨基酸的密碼子,也替換了少量編碼A、C、V等氨基酸的密碼子.然后將人工合成的修改基因插入表達(dá)質(zhì)粒pPICZaA并轉(zhuǎn)化入P.pastoris.通過在自控發(fā)酵罐中高密度發(fā)酵重組酵母,使重組Anp蛋白的產(chǎn)量達(dá)到

2、了290U/mL,約為親本株產(chǎn)量的500倍左右.同樣根據(jù)P.pastoris中密碼子的使用情況(本文使用TTT編碼F,TTG編碼L,ATT編碼I,ATG編碼M,GTT編碼V,TCT編碼S,TGT編碼C,ACT編碼T,GCT編碼A,GGT編碼G,CAT編碼H,CAA編碼Q,AAC編碼N,AAG編碼K,GAT編碼D,GAA編碼E,CCA編碼P,TGG編碼W,AGA編碼R,TAC編碼Y),將Lip1成熟多肽序列轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的DNA序列.然后將該

3、人工合成的改造后基因插入表達(dá)質(zhì)粒pGAPZaA并轉(zhuǎn)化入P.pastoris.通過高密度發(fā)酵,使重組Lip1蛋白的產(chǎn)量達(dá)到了7000U/mL,提高到親本株產(chǎn)量的70倍左右.本文探索了一種改進植酸酶催化性質(zhì)的新策略——基于結(jié)構(gòu)的片段改組(Structure-Based Fragment Shuffling,SBFS)來實現(xiàn)上述目的.本文也通過比較各種SBFSp的pH曲線以探索各Anp來源小片段對它們pH曲線的影響.發(fā)現(xiàn)除SG外的所有小片段對

4、SBFSp在各個pH上的比活都有影響.本文更進一步發(fā)現(xiàn)SD與SE對曲線所施加的影響互相拮抗從而導(dǎo)致了上述的這種矛盾:雖然SD或SE在SBFSp中單獨出現(xiàn),可以促進pH2.5-5.0范圍內(nèi)比活的上升;但這兩個小片段在SBFSp中同時出現(xiàn)(如上述的98＃與65＃比)卻反而使得該pH范圍內(nèi)的比活降低.SE對pH曲線的影響可以與先前報道的第277位與第282位的定點突變實驗結(jié)果吻合.而其他各種小片段對pH曲線的影響,先前均未見報道,可為植酸酶的