鋁經(jīng)cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導途徑損害大鼠海馬長時記憶的機制.pdf

1、目的：
　　 鋁（aluminium，Al）在生活中接觸十分頻繁。它是非必需的微量元素之一。據(jù)WHO報道，含鋁的食品添加劑是人民大眾鋁暴露的主要途徑。飲食中鋁的來源有四個方面，包括飲水，天然食物，含鋁食品添加劑及鋁制炊具、容器。20世紀70年代前認為，鋁與鋁鹽是不被人體所吸收的，無急慢性毒性。70年代中期以來，國內(nèi)外學者對鋁的毒性展開深入研究后認為:鋁的過度接觸和體內(nèi)蓄積可對神經(jīng)系統(tǒng)造成損害。在許多人類神經(jīng)系統(tǒng)疾病中，如透析性腦

2、病、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默癥等，均發(fā)現(xiàn)CNS中存在異常的鋁積聚現(xiàn)象。最近的研究表明，腦鋁與β淀粉樣蛋白有聯(lián)系。β淀粉樣蛋白可以大大削弱海馬的長時程增強。盡管除了透析性腦病，鋁是否就是這些疾病的病因還存有爭議，但提升劑量確實能誘發(fā)或加重病理過程。提示，鋁很可能是智力低下性神經(jīng)疾病的一個重要的環(huán)境致病因子。
　　 當前，鋁對于學習記憶能力的損害作用及其機制是神經(jīng)毒理學研究的一個熱點問題。海馬是學習記憶的關鍵部位。海馬長時程增

3、強(Long-term potentiation，LTP)是腦學習記憶功能在突觸水平的研究模型和細胞基礎，是公認的研究學習記憶的電生理模型。LTP的誘導與維持都與學習記憶能力緊密相關，其中晚期長時程增強(late-phase LTP, L-LTP)與長時記憶密切相關，其維持需要新的基因轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導途徑對于L-LTP的維持至關重要，在學習記憶的信號傳導中發(fā)揮重要作用。鋁可對LTP的維持期造成損害，但

4、相關機制并不明確。
　　 本研究采用亞慢性經(jīng)口染鋁（AlCl3水溶液）的方式，建立亞慢性AlCl3暴露導致記憶能力受損的動物模型（從子代大鼠出生后立即給予AlCl3染毒，連續(xù)3個月）。本實驗以仔鼠為研究對象，運用病理學、神經(jīng)行為學、電生理學、生物化學和分子生物學多種技術手段，從血和腦內(nèi)的鋁含量、海馬神經(jīng)元和突觸的病理形態(tài)改變、動物神經(jīng)行為學改變、海馬CA1區(qū)L-LTP的誘導和維持、細胞內(nèi)游離Ca2+濃度，細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導通路（受體

5、-G蛋白-AC-cAMP-PKA-CREB通路），以及基因表達等多角度探討不同劑量水平鋁暴露對于學習記憶功能的危害，進一步探討相關機制。
　　 方法：
　　 由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供的Wistar大鼠60只，體重260±10g，雌雄比例2∶1。實驗動物室溫度17～23℃，相應濕度45～55％，動物飼料由實驗動物中心提供。隨機將雌鼠分為對照組和低、中、高劑量AlCl3組，然后將雌雄大鼠按2∶1同籠進行交配，次日晨發(fā)現(xiàn)

6、陰栓或陰道分泌物鏡檢有精子者定為受孕，記為妊娠第0d。子代大鼠剛出生后記做出生第1d，并立即給予AlCl3染毒。對照組孕鼠在產(chǎn)子后飲用蒸餾水，低、中、高劑量AlCl3組孕鼠在產(chǎn)子后分別飲用0.2％、0.4％、0.6％ AlCl3蒸餾水溶液。各染鋁組仔鼠在斷乳前經(jīng)由吸吮母乳染鋁，斷乳后則通過自行飲水攝鋁，至出生后3個月結(jié)束，然后進行各項指標測定。
　　 采用原子吸收光譜法測定仔鼠血液和海馬組織鋁含量，稱量體重及臟器系數(shù)，采用跳臺實

7、驗、穿梭箱實驗和Morris水迷宮實驗測定仔鼠的學習記憶能力，采用HE染色法觀察仔鼠海馬神經(jīng)細胞形態(tài)，采用透射電鏡技術觀察仔鼠海馬組織神經(jīng)元和神經(jīng)突觸超微結(jié)構(gòu)，采用細胞外微電極記錄技術檢測染鋁動物大鼠海馬CAl-CA3途徑L-LTP的誘導和維持情況，采用Fura-2熒光探針法測定細胞內(nèi)游離Ca2+濃度，采用放射免疫法(RIA)測定各組仔鼠海馬組織中cAMP濃度，采用免疫印跡(Westem blot)法測定各組仔鼠海馬組織中PKA和c-J

8、un蛋白含量，采用免疫組織化學法測定各組仔鼠海馬組織中胞核內(nèi)磷酸化CREB含量、胞漿內(nèi)BDNF蛋白含量，采用RT-PCR法測定各組仔鼠海馬BDNF mRNA表達水平，采用免疫熒光組化染色技術測定各組仔鼠海馬組織中BDNF蛋白含量，并用激光共聚焦掃描顯微鏡觀察和攝片。
　　 結(jié)果：
　　 一、AlCl3對大鼠記憶能力和海馬超微結(jié)構(gòu)的影響
　　 1、不同劑量鋁暴露對仔鼠體重、海馬及腦系數(shù)等的影響
　　 各劑量

9、組仔鼠的體重與對照組相比呈現(xiàn)不同程度的降低趨勢。各劑量組的海馬系數(shù)、腦系數(shù)和海馬/腦比值與對照組相比均呈現(xiàn)不同程度的升高趨勢。
　　 2、各組仔鼠血液和海馬組織中鋁含量測定
　　 染鋁各組仔鼠的血鋁濃度均顯著高于對照組(P＜0.01)，且隨著鋁暴露劑量的增加，血鋁濃度呈現(xiàn)一定的升高趨勢;腦鋁的變化趨勢與血鋁一致。
　　 3、各組仔鼠在學習、記憶（神經(jīng)）行為學方面的結(jié)果評價
　　 (1)跳臺實驗
　　

10、 在仔鼠跳臺實驗中，學習反應時間隨染鋁劑量的增加而延長，高劑量組學習反應時間顯著長于對照組(P＜0.01)。學習錯誤次數(shù)隨染鋁劑量的增加而增加，并有一定的劑量效應關系(P＜0.05);在仔鼠跳臺實驗中，隨著染毒劑量的增加，各劑量組記憶潛伏期有顯著縮短的趨勢。記憶錯誤次數(shù)隨染鋁劑量的增加而增加，各組之間有一定的劑量-效應關系(P＜0.01)。
　　 (2)穿梭箱實驗
　　 被動逃避反應指標中，在電擊次數(shù)方面，高、中劑量組

11、與對照組比較，電擊次數(shù)顯著增多，差異具有顯著性(P＜0.01)。在電擊時間方面，中、高劑量組顯著高于對照組(P＜0.01);在主動逃避時間和主動逃避潛伏時間方面，中、高劑量組與對照組比較，兩項指標均顯著延長(P＜0.01)，且與低劑量組比較也顯著延長(P＜0.01)。
　　 (3) Moris水迷宮實驗
　　 在仔鼠Morris水迷宮實驗中，隨著染鋁劑量的增加，仔鼠尋找平臺的時間逐漸延長并有一定的劑量-效應關系(P＜0.

12、01)。與對照組比較，低、中、高劑量組的潛伏期增大，具有顯著性差異(P＜0.05);隨著染鋁劑量的增加，仔鼠的平均速度在實驗過程中逐漸降低，運行軌跡呈現(xiàn)越來越復雜的趨勢。
　　 4、各組仔鼠海馬內(nèi)神經(jīng)細胞形態(tài)學觀察
　　 HE染色后，各劑量組隨著染毒劑量的增加，光鏡下神經(jīng)細胞形態(tài)呈現(xiàn)典型的神經(jīng)細胞受損傷樣改變:染色明顯減弱，數(shù)目減少，細胞層次少而不清，脫失現(xiàn)象明顯，細胞空泡變性較明顯。
　　 5、各組仔鼠海馬神經(jīng)

13、元細胞超微結(jié)構(gòu)觀察
　　 隨著染毒劑量的增加，海馬神經(jīng)元細胞核膜界限模糊，甚至局部有斷裂，部分細胞質(zhì)溶解，無法辨認細胞器。核內(nèi)常染色質(zhì)減少，異染色質(zhì)增加，核內(nèi)有空泡樣改變。核仁不規(guī)則、邊集。線粒體腫脹，嵴大部分溶解。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)變短并有中度擴張;隨著鋁暴露濃度的增加，海馬突觸活性帶變短，突觸后致密物較少，突觸間隙變窄，突觸小泡較少，甚至突觸內(nèi)有空泡現(xiàn)象。
　　 二、AlCl3對大鼠海馬細胞內(nèi)鈣濃度和CA1區(qū)L-LTP的影響

14、
　　 （一）不同劑量鋁暴露對各組仔鼠海馬CA1區(qū)L-LTP的影響
　　 1、HFS前反應
　　 隨著染毒劑量的增加，各組仔鼠高頻刺激前PS平均幅值略有降低的趨勢，但各劑量組間不具有顯著性差異(P＞0.05)。
　　 2、HFS后反應
　　 (1)不同劑量鋁暴露對各組仔鼠LTP和LTD發(fā)生率的影響
　　 HFS后，隨著鋁暴露劑量的增加，與對照組相比，各鋁暴露組L-LTP發(fā)生率逐漸降低，甚至

15、部分動物出現(xiàn)了LTD，尤其在高劑量組情況最為嚴重。而LTD發(fā)生率隨著鋁暴露劑量的增加有逐漸升高的趨勢，高劑量組LTD發(fā)生率明顯高于對照組和低劑量組。對照組L-LTP發(fā)生率為85.71％;低劑量組L-LTP發(fā)生率為75.00％;中劑量組L-LTP發(fā)生率為75.00％，LTD發(fā)生率為12.50％;高劑量組L-LTP發(fā)生率為66.67％，LTD發(fā)生率為22.22％。
　　 (2)不同劑量鋁暴露對各組仔鼠HFS后PS平均幅值增強率的影響

16、
　　 隨著染毒劑量的增加，各組仔鼠高頻刺激后PS平均幅值增強率明顯下降，各劑量組間具有顯著性差異，并呈現(xiàn)一定的劑量效應關系(P＜0.01)。與對照組相比，低、中、高劑量組PS平均幅值增強率降低，各組間均具有顯著性差異(P＜0.05);與低劑量組相比，中、高劑量組PS平均幅值增強率降低，各組間均具有顯著性差異(P＜0.05);與中劑量組相比，高劑量組PS平均幅值增強率降低，但兩組間比較沒有顯著性差異(P＞0.05)。
　　

17、 （二）各組仔鼠海馬神經(jīng)元細胞內(nèi)Ca2+濃度變化
　　 隨著鋁暴露劑量的增加，細胞內(nèi)Ca2+濃度逐漸降低。低、中、高劑量AlCl3組仔鼠海馬細胞內(nèi)Ca2+濃度明顯低于對照組，差異均具有顯著性(P＜0.01)。與低劑量組相比，中、高劑量AlCl3組仔鼠海馬細胞內(nèi)Ca2+濃度降低，且有顯著性差異，(P＜0.05)。
　　 三、AlCl3對大鼠海馬cAMP-PKA-CREB信號轉(zhuǎn)導通路的影響
　　 1、AlCl3對各

18、組仔鼠海馬c-AMP濃度的影響
　　 L-LTP后，中、高劑量組仔鼠海馬c-AMP濃度與對照組比較均顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，低劑量組比對照組濃度低，但差異不具有顯著性(P＞0.05);高劑量組c-AMP濃度顯著低于低、中染鋁組，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 2、AlCl3對各組仔鼠海馬PKA蛋白含量的影響
　　 L-LTP后，對照組、低、中、高劑量組仔鼠海馬PKA蛋白表達水平隨著染毒劑

19、量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢，存在明顯的劑量-效應關系(P＜0.01)。各劑量組與對照組相比，PKA蛋白表達水平均顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.01);中、高劑量組與低劑量組相比，PKA蛋白表達水平均顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.01);高劑量組與低劑量組之間比較，PKA蛋白表達水平顯著降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 3、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)p-CREB蛋白含量的影響
　　 L-LTP后，子代大

20、鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和皮質(zhì)區(qū)p-CREB的累積積分光密度隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在CA1區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，高劑量組與低劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05);在CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，高劑量組與低劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01);在皮質(zhì)區(qū)，低、

21、中、高劑量組與對照組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 4、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)BDNF mRNA表達的影響
　　 L-LTP后，隨著染毒劑量的增加，對照組、低、中、高劑量組海馬內(nèi)的BDNFmRNA表達呈現(xiàn)下降趨勢，存在明顯的劑量-效應關系。各劑量組海馬內(nèi)BDNFmRNA表達與對照組比較均降低，差異具有顯著性

22、(P＜0.01);中、高劑量組與低劑量組比較，海馬內(nèi)的BDNF mRNA表達均下降，差異具有顯著性(P＜0.05);高劑量組與中劑量組比較，海馬內(nèi)的BDNF mRNA表達下降，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 5、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)BDNF蛋白含量的影響
　　 (1)免疫組化法
　　 L-LTP后，子代大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和皮質(zhì)區(qū)BDNF累積積分光密度隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在C

23、A1和CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05);在皮質(zhì)區(qū)，中、高劑量組與對照組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比累積積分光密度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)。
　　 L-LTP后

24、，子代大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)和皮質(zhì)區(qū)BDNF陽性面積比隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在CA1和CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比，陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01);在皮質(zhì)區(qū)，低、中、高劑量組與對照組相比陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑

25、量組相比陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，陽性面積比降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 (2)免疫熒光組化染色法
　　 L-LTP后，子代大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、皮質(zhì)區(qū)和DG區(qū)BDNF的平均熒光強度隨著染毒劑量的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢。在CA1區(qū)，中、高劑量組與對照組相比平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與低劑量組相比，平均熒光強度降低，差異具有

26、顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組性比，平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.05);在CA3區(qū)，中、高劑量組與對照組相比平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。在皮質(zhì)區(qū)，中、高劑量組與對照組相比平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，中、高劑量組與低劑量組相比平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。高劑量組與中劑量組比

27、，平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。在DG區(qū)，低、中、高劑量組與對照組相比平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.05)，高劑量組與低劑量組相比，平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)，高劑量組與中劑量組相比，平均熒光強度降低，差異具有顯著性(P＜0.01)。
　　 6、AlCl3對各組仔鼠海馬內(nèi)c-Jun蛋白含量的影響
　　 L-LTP后，隨著染毒劑量的增加，對照、低、中、高劑量組海馬內(nèi)c-

28、Jun蛋白含量呈現(xiàn)下降趨勢，存在明顯的劑量-效應關系(P＜0.01)。各劑量組海馬內(nèi)c-Jun蛋白含量與對照組比較均降低，差異具有顯著性(P＜0.01);中、高劑量組與低劑量組比較，海馬內(nèi)的c-Jun蛋白含量均下降，差異具有顯著性(P＜0.01);高劑量組與中劑量組比較，海馬內(nèi)c-Jun蛋白含量略下降，但差異不具有顯著性(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、出生后亞慢性AlCl3暴露導致仔鼠學習記憶能力低下，海馬神

29、經(jīng)細胞形態(tài)異常，海馬神經(jīng)元和神經(jīng)突觸的超微結(jié)構(gòu)受到損害。
　　 2、出生后亞慢性AlCl3暴露引起仔鼠海馬神經(jīng)細胞內(nèi)游離鈣濃度降低，損害仔鼠海馬CA1區(qū)L-LTP誘導和維持，降低L-LTP發(fā)生率和PS平均幅值增強率，并導致產(chǎn)生LTD，從而產(chǎn)生損害作用，影響仔鼠的學習記憶功能。
　　 3、出生后亞慢性AlCl3暴露降低仔鼠海馬c-AMP濃度，減少PKA蛋白含量，降低p-CREB活化水平，造成與學習記憶能力密切相關的cAMP