聯(lián)合蛋白質(zhì)組學和代謝組學探討高膽固醇血癥影響肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的表達規(guī)律及臨床意義.pdf

1、藥物轉(zhuǎn)運體是一類分布于細胞膜上介導內(nèi)外源性物質(zhì)的跨膜轉(zhuǎn)運的蛋白質(zhì)。作為體內(nèi)重要的內(nèi)外源性物質(zhì)消除器官，肝臟分布著多種藥物轉(zhuǎn)運體，如OATP1B1、OATP1B3、OATP2B1、OAT2、OAT7、OCT1、NTCP等攝入型藥物轉(zhuǎn)運體與MRP3、MRP4、MRP6、BCRP（ABCG2）、BSEP（ABCB11）、MRP2（ABCC2）、P-GP、MATE1等外排型藥物轉(zhuǎn)運體。肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的生理功能是將大多數(shù)內(nèi)源性物質(zhì)、外源性藥物等攝

2、取入肝細胞,再經(jīng)肝細胞的藥物代謝酶的生物轉(zhuǎn)化，最終將其經(jīng)膽汁排至體外，因此肝臟轉(zhuǎn)運體對肝細胞在攝取、代謝與排泄內(nèi)外源性物質(zhì)的功能方面發(fā)揮著重要作用。肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的表達與功能異常導致血漿藥物濃度改變，從而引起其藥效學效應變化，可能產(chǎn)生治療無效，甚至藥物蓄積導致毒副作用。
　　肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的表達與活性常受藥物、疾病等多種因素的影響。糖尿病、肥胖等眾多疾病都可影響肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的表達與活性。而目前關(guān)于高膽固醇血癥影響肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的

3、表達與活性的報道較少。故本研究擬考察高膽固醇血癥影響肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的表達規(guī)律及可能的調(diào)控機制，從而揭示高膽固醇血癥通過藥物轉(zhuǎn)運體產(chǎn)生疾病-藥物間相互作用的可能性，為高膽固醇血癥患者的合理臨床用藥提供重要參考。
　　第一章:高膽固醇血癥血清代謝變化的代謝組學研究
　　實驗目的：
　　主要采用代謝組學技術(shù)分析高膽固醇血癥血清代謝變化，分析受高膽固醇血癥影響的代謝通路，初步考察引起血清代謝物變化的可能藥物轉(zhuǎn)運體。
　　

4、實驗方法：
　　1.采用飼喂大鼠高膽固醇飲食造成高膽固醇血癥模型。
　　2.常規(guī)生化分析技術(shù)檢測高膽固醇血癥血清生化指標變化。
　　3.非靶向LC-MS/MS的代謝組學技術(shù)分析高膽固醇血癥血清代謝成分變化。
　　4.多元統(tǒng)計分析研究高膽固醇血癥的代謝組特征，并篩選出高膽固醇血癥密切相關(guān)的標志性代謝物。
　　實驗結(jié)果：
　　1.大鼠經(jīng)8周高膽固醇飼料喂養(yǎng)后，高膽固醇血癥組大鼠血清總膽固醇(TC)、低密度

5、脂蛋白膽固醇(LDL-C)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、TC/HDL-C、LDL-C/HDL-C明顯高于對照組（P<0.05），但甘油三酯(TG)與對照組無差異，表明高膽固醇血癥模型已成功構(gòu)建。
　　2.與對照組相比，高膽固醇血癥組總膽酸、總膽紅素、直接膽紅素、肌酐、尿素、尿酸都明顯升高（P<0.05），但血糖、AST、ALT并未升高。生化分析結(jié)果初步提示高膽固醇血癥存在代謝紊亂。
　　3.代謝組學結(jié)合多元統(tǒng)計分析揭示

6、出高膽固醇血癥血清中多種差異代謝物升高，如肌酸、肌酐、甘氨膽酸、多種氨基酸如甲硫氨酸等，提示高膽固醇血癥存在氨基酸、膽酸與肌酸代謝紊亂。
　　實驗結(jié)論：
　　高膽固醇血癥存在明顯代謝紊亂，如膽紅素、膽酸、肌酸與氨基酸代謝紊亂。直接膽紅素、膽酸等代謝分子的升高提示肝臟中相應的藥物轉(zhuǎn)運體的表達與功能可能受到抑制。
　　第二章:高膽固醇血癥影響肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的蛋白組學研究
　　實驗目的：
　　探討高膽固醇血癥影響

7、肝臟藥物轉(zhuǎn)運體的表達規(guī)律及可能的調(diào)控機制。
　　實驗方法：
　　1.iTRAQ標記結(jié)合LC-MS/MS的蛋白（質(zhì)）組學技術(shù)分析受高膽固醇血癥影響的肝臟差異表達蛋白。
　　2.生物信息學技術(shù)，如GO分析、通路分析與上游調(diào)控分子分析，篩選受到高膽固醇血癥調(diào)控的藥物轉(zhuǎn)運體及其信號機制。
　　3.RT-qPCR與western blot方法分別從mRNA和蛋白水平確證候選藥物轉(zhuǎn)運體表達趨勢的可靠性。
　　實驗結(jié)果：

8、
　　1.蛋白組學結(jié)果表明，與對照組相比，高膽固醇血癥組差異表達蛋白共有239個，其中上調(diào)表達188個，下調(diào)表達51個（P<0.05，表達變化大于2倍，至少2條可信肽段）。
　　2.GO分析表明差異表達蛋白發(fā)揮結(jié)合功能，催化活性與轉(zhuǎn)運功能等。參與轉(zhuǎn)運功能的差異表達蛋白中鑒定出MRP2、OAT2等多種藥物轉(zhuǎn)運體。與對照組相比，高膽固醇血癥大鼠肝臟的MRP2與OAT2表達下降。
　　3.通路分析與上游調(diào)控分子分析表明OAT

9、2與MRP2既受到多種核受體調(diào)控，亦受到炎癥因子調(diào)控。
　　4.RT-qPCR與western blot方法表明高膽固醇血癥大鼠肝臟MRP2與OAT2的表達下調(diào)，證實蛋白組學鑒定結(jié)果的可靠性。
　　實驗結(jié)論：
　　iTRAQ標記結(jié)合LC-MS/MS的蛋白組學、生物信息學、RT-qPCR與western blot等技術(shù)鑒定出高膽固醇血癥下調(diào)肝臟藥物轉(zhuǎn)運體MRP2與OAT2的表達。其次，藥物轉(zhuǎn)運體MRP2與OAT2的表達受

10、到核受體與炎癥因子調(diào)控，提示炎癥性疾病高膽固醇血癥可能通過炎癥因子抑制核受體功能繼而下調(diào)肝臟表達藥物轉(zhuǎn)運體MRP2與OAT2。
　　第三章:高膽固醇血癥下調(diào)藥物轉(zhuǎn)運體MRP2與OAT2表達的機制研究
　　實驗目的：
　　探索高膽固醇血癥調(diào)控MRP2與OAT2表達的分子機制。
　　實驗方法：
　　1.RT-qPCR與western blot方法分析高膽固醇血癥影響的肝臟核受體變化趨勢。
　　2.West

11、ern blot方法考察LXRα激動劑對高膽固醇血清或炎癥因子TNF-α所下調(diào)MRP2與OAT2的表達影響。
　　3.流式細胞術(shù)分析 LXRα激動劑對高膽固醇血清或炎癥因子TNF-α所下調(diào)MRP2轉(zhuǎn)運活性的影響。
　　實驗結(jié)果：
　　1.與對照組相比，高膽固醇血癥組肝臟LXRαmRNA表達明顯下降（P<0.05），CAR mRNA表達則明顯上升（P<0.05），其他核受體FXR、PXR、PPARγ mRNA表達無明顯變

12、化；LXRα蛋白表達也呈同樣趨勢（P<0.05）。結(jié)果提示 LXRα與 CAR可能參與高膽固醇血癥下調(diào)肝臟表達MRP2與OAT2。
　　2.與正常血清相比，高膽固醇血清下調(diào)HepG2細胞的 MRP2與OAT2表達（P<0.05），但LXRα激動劑T0901317能回復高膽固醇血清所下調(diào)MRP2與OAT2表達（P<0.05）。同樣，與對照組相比，TNF-α下調(diào)HepG2細胞的MRP2與OAT2表達（P<0.05），但LXRα激動劑T

13、0901317能回復TNF-α所下調(diào)MRP2與OAT2表達（P<0.05）。結(jié)果進一步證實高膽固醇血癥通過下調(diào)LXRα功能來抑制肝細胞表達MRP2與OAT2。
　　3.與正常血清相比，高膽固醇血清下調(diào)HepG2細胞的MRP2外排底物CDCFDA（P<0.05）；但LXRα激動劑T0901317能回復MRP2外排活性（P<0.05）。同樣，與對照組相比，TNF-α下調(diào)HepG2細胞的MRP2外排底物CDCFDA（P<0.05）；但L

14、XRα激動劑T0901317能回復TNF-α所下調(diào)MRP2外排活性（P<0.05）。結(jié)果證實高膽固醇血癥通過下調(diào)LXRα功能來抑制肝細胞MRP2的轉(zhuǎn)運活性。
　　實驗結(jié)論：
　　高膽固醇血癥通過抑制核受體LXRα信號通路來下調(diào)肝臟的MRP2與OAT2的表達與活性。升高的炎癥因子TNF-α至少部分介導高膽固醇血癥的上述作用。
　　第四章:高膽固醇血癥下調(diào)藥物轉(zhuǎn)運體MRP2與OAT2活性的臨床意義分析
　　實驗目的：

15、
　　考察高膽固醇血癥患者是否存在MRP2與OAT2的活性降低現(xiàn)象。
　　實驗方法：
　　1.比較高膽固醇血癥人群與正常對照人群的 MRP2底物直接膽紅
　　素與OAT2底物尿酸與肌酐的血清濃度。
　　2.分析血脂水平與MRP2及OAT2底物血清水平的相關(guān)性。
　　實驗結(jié)果：
　　1.與正常對照組相比，高膽固醇血癥組患者的BMI、收縮壓、舒張壓、TC、LDL-C、HDL-C、TG、AST、ALT

16、、總膽紅素、間接膽紅素、尿素都明顯升高（P<0.05）。而兩組間年齡、性別、血糖、總蛋白、球蛋白、白蛋白則無統(tǒng)計學差異。
　　2.與正常對照組相比，高膽固醇血癥組患者的直接膽紅素明顯升高（P<0.05），提示肝臟MRP2活性降低。同樣，高膽固醇血癥組患者的尿酸與肌酐明顯升高（P<0.05），提示OAT2活性降低。
　　3.相關(guān)性分析表明TC及LDL-C與直接膽紅素、尿酸、肌酐等都成正相關(guān)，且具統(tǒng)計學差異（P<0.05）。TG