CCR4-NOT復(fù)合物家族成員CNOT9和蛋白酶體11S激活因子家族成員REGγ突變體的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)研究.pdf

1、CCR4-NOT復(fù)合物在生物體中具有重要的作用，它參與細(xì)胞不同水平基因表達(dá)的調(diào)控過程中，在真核生物中高度保守。該復(fù)合物共有九個(gè)亞基構(gòu)成，各自具有獨(dú)特的生物學(xué)功能。CNOT9亞基在物種進(jìn)化中表現(xiàn)出很高的保守性，具有臂狀(ARM)重復(fù)結(jié)構(gòu)單元，表面帶有正電荷的凹槽能夠結(jié)合寡聚核苷酸，但對(duì)poly(G)、poly(C)及poly(T)親和性遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于poly(A)。研究發(fā)現(xiàn)CNOT9在體外可以抑制CNOT7的脫腺苷酸化酶的活性，但兩者之間并沒有

2、直接的相互作用，由此推測CNOT9發(fā)揮調(diào)控作用的機(jī)制可能與核苷酸的結(jié)合相關(guān)，但尚未得到CNOT9與寡聚核苷酸復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，無法深入探討調(diào)控機(jī)制。
　　 REGγ屬于11S蛋白酶體激活因子同源蛋白之一，與另外兩種同源蛋白R(shí)EGα、β不同的是，它能夠特異性的激活20S蛋白酶體降解堿性氨基酸殘基形成的肽鍵。這一特異性暗示出REGγ具有獨(dú)特的激活機(jī)制。此外，REGγ參與到多種細(xì)胞生命活動(dòng)中例如細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡等，在重大疾

3、病發(fā)病機(jī)理中也發(fā)揮重要的作用。但現(xiàn)階段，對(duì)REGγ獨(dú)特的激活機(jī)制的認(rèn)識(shí)仍十分有限，能夠揭示其重要生理功能機(jī)理的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)比較匱乏。
　　 本論文利用結(jié)構(gòu)生物學(xué)手段，采用多種蛋白質(zhì)分離純化的方法，經(jīng)過蛋白質(zhì)結(jié)晶條件的篩選，獲得高質(zhì)量蛋白晶體。通過X射線衍射技術(shù)，解析得到了CNOT9-poly(G)、CNOT9-GMP復(fù)合物和REGγ-linker雙突變體(K188E/D149A)的晶體結(jié)構(gòu)，分辨率分別為2.3(A)、2.25(A)和

4、2.45(A)。
　　 CNOT9-poly(G)復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示在正電荷凹槽處存在底物的電子密度但無法確定其為DNA，暗示出核苷酸與CNOT9的結(jié)合可能是非特異性的;CNOT9-GMP復(fù)合物結(jié)構(gòu)揭示出單個(gè)核苷酸與正電荷凹槽處的結(jié)合位點(diǎn)，并在晶體結(jié)構(gòu)中觀察到另外三處結(jié)合位點(diǎn)。通過多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，結(jié)合位點(diǎn)處關(guān)鍵氨基酸殘基高度保守，推測CNOT9與核苷酸結(jié)合的能力是進(jìn)化過程中重要的保守的功能。
　　 REGγ-linker雙突