DEHP和MEHP神經(jīng)發(fā)育毒性的體外研究.pdf

1、DEHP是塑料工業(yè)最主要的改性添加劑，全球年產(chǎn)量達300～400萬噸，廣泛應(yīng)用于各種塑料產(chǎn)品中。DEHP 僅依靠分子間作用力而不是化學(xué)鍵與塑料主體基質(zhì)結(jié)合，因此可不斷地從塑料制品中游離出來，通過各種途徑進入人體。DEHP對人的急性毒性較低，慢性毒性尚不明確，但大量的動物實驗和一些流行病學(xué)研究提示DEHP及其代謝產(chǎn)物MEHP 可對發(fā)育中及成年個體的多種組織系統(tǒng)包括肝、生殖系統(tǒng)、腎、肺及心臟等產(chǎn)生廣泛的慢性毒性作用，并具有致畸性、致突變性和

2、致癌性。由于目前的毒理學(xué)實驗沒有充分涵蓋對受試物的神經(jīng)毒性評價，而處于發(fā)育階段的神經(jīng)系統(tǒng)對毒物作用更為敏感，因此本文以PC12細胞作為神經(jīng)元細胞模型，以C6細胞作為神經(jīng)膠質(zhì)細胞模型，研究DEHP、MEHP對神經(jīng)細胞增殖、分化過程的影響，對DEHP的神經(jīng)發(fā)育毒性作用進行初步評價。
　　 第一部分
　　 目的：以未分化PC12細胞為模型，研究DEHP、MEHP對其增殖和分化過程的影響，從而評價其對神經(jīng)元的發(fā)育毒性。方法：對未

3、分化型PC12細胞進行培養(yǎng)；研究受試物的細胞增殖毒性時，向各組加入含有不同濃度（0.1～100mg/L）DEHP 或MEHP的培養(yǎng)液，同時設(shè)立空白對照及0.1％DMSO的溶劑對照。對受試物細胞增殖毒性的評價方法包括：改良MTT 法檢測細胞生長曲線的影響、臺盼藍染料排斥法檢測活細胞百分比、流式細胞術(shù)檢測細胞周期以及流式細胞術(shù)和ELISA 法檢測細胞DNA 合成水平。研究受試物對細胞分化的影響時，向各組加入含有50ng/mL 鼠2.5S 神

4、經(jīng)生長因子（NGF）及不同濃度（0.1～100mg/L）DEHP 或MEHP的培養(yǎng)液，同時設(shè)立空白對照及0.1％DMSO的溶劑對照。評價受試物對細胞分化影響的方法包括：鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化并測定突起細胞陽性比例、分級分離獲取細胞膜蛋白和骨架蛋白并分別應(yīng)用BCA 法和Bradford 法測定其含量、提取PC12細胞總RNA 并以逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR 測定細胞ChAT mRNA、TH mRNA和GAPDH mRNA水平。結(jié)果：在實驗濃

5、度范圍內(nèi)，DEHP、MEHP對未分化型PC12細胞均無細胞毒性；0.1～100mg/L DEHP對未分化型PC12細胞的活力、細胞周期中各期細胞比例及細胞的DNA 合成水平均無影響；1.6～100mg/L MEHP降低未分化型PC12細胞的活力,且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；0.1～100mg/L MEHP 使細胞周期中S 期細胞比例降低，G2 期細胞比例升高，DNA 合成水平下降，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。培養(yǎng)液中加入

6、鼠2.5S 神經(jīng)生長因子誘導(dǎo)PC12細胞分化時，1～100mg/L的DEHP和10～100mg/L MEHP 使分化中PC12細胞的膜蛋白、細胞骨架蛋白的含量增加，突起細胞陽性比例增加；以GAPDH mRNA為參照，實驗濃度范圍內(nèi)的DEHP和MEHP對ChAT mRNA水平?jīng)]有影響，對THmRNA水平起下調(diào)作用，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。結(jié)論：0.1～100mg/L的DEHP對未分化型PC12細胞的增殖沒有影響，而低至0.1m

7、g/L的MEHP 即可對未分化型PC12細胞的增殖產(chǎn)生抑制作用。1～100mg/LDEHP和10～100mg/L MEHP 均可促進NGF 誘導(dǎo)的未分化型PC12細胞向膽堿能交感神經(jīng)樣細胞分化。
　　 第二部分目的：以C6細胞為模型，研究DEHP及其代謝物MEHP對其增殖和分化過程的影響，從而評價其對神經(jīng)膠質(zhì)細胞的發(fā)育毒性。方法：對C6細胞進行培養(yǎng)；研究受試物的細胞增殖毒性時，方法同第一部分。研究受試物對細胞分化的影響時，向各組

8、加入含有2mM 丁酸鈉及不同濃度（0.1～100mg/L）DEHP 或MEHP的培養(yǎng)液，同時設(shè)立空白對照及0.1％DMSO的溶劑對照。評價受試物對細胞分化影響的方法包括：鏡下觀察細胞的形態(tài)學(xué)變化并測定延展細胞陽性比例、分離獲取細胞骨架蛋白并以Bradford 法測定其含量、提取C6細胞總RNA 并以逆轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR 測定細胞GFAP mRNA和GAPDH mRNA水平。結(jié)果：在實驗濃度范圍內(nèi)，DEHP、MEHP對C6細胞均無細胞毒

9、性；0.4mg/LDEHP 可以使細胞生長曲線提高但對細胞周期和DNA合成水平無影響；1.6～100mg/L DEHP對C6細胞的活力沒有影響；0.1～100mg/L DEHP對C6細胞的DNA 合成水平和細胞周期中各期細胞比例均無影響；1.6～100mg/L MEHP抑制C6細胞的活性，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P＜0.05）；0.1～100mg/L MEHP 使細胞周期中S 期細胞比例降低，G2 期細胞比例升高，DNA 合成水平下降，且存

10、在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。培養(yǎng)液中加入丁酸鈉誘導(dǎo)C6細胞分化時，1～100mg/L的DEHP和10～100mg/L MEHP 使分化中C6細胞的細胞骨架蛋白含量增加，延展細胞陽性比例升高（P<0.05）；以GAPDH mRNA為參照，1～100mg/L的DEHP和MEHP上調(diào)GFAPmRNA水平，且存在劑量效應(yīng)關(guān)系（P<0.05）。結(jié)論：0.1～100mg/L的DEHP對C6細胞的增殖沒有影響，而低至0.1mg/L的MEHP 即可