鉤端螺旋體對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞單層侵襲性研究及rel基因功能分析.pdf

1、鉤端螺旋體?。ㄒ韵潞?jiǎn)稱鉤體?。┦怯芍虏⌒糟^端螺旋體(以下簡(jiǎn)稱鉤體)感染引起的人獸共患病，鼠類和豬是主要的傳染源，在全世界范圍內(nèi)廣泛流行。
　　 鉤體的致病機(jī)制目前并不明確。黏附和侵襲是鉤體致病的第一步。鉤體可以通過破損的皮膚和黏膜進(jìn)入人體，并迅速進(jìn)入到血管，隨血流到達(dá)靶器官后定植。這一過程在鉤體致病中發(fā)揮著十分重要的作用。因此，本研究的第一部分首先利用Transwell小室和EAhy926細(xì)胞建立內(nèi)皮細(xì)胞單層模型，在體外模擬血管

2、壁結(jié)構(gòu)，分別加入鉤體有毒株56606v株，減毒株56606a株、腐生型PatocⅠ株、傷寒沙門菌14028菌株（陽性對(duì)照）和大腸埃希菌DH5α菌株（陰性對(duì)照），暗視野顯微鏡下計(jì)數(shù)到達(dá)Transwell下室細(xì)菌的數(shù)量，吸取下室液體檢測(cè)熒光強(qiáng)度以評(píng)估內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性改變，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)鉤體是否引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，透射電鏡下觀察鉤體穿透內(nèi)皮細(xì)胞單層的形態(tài)特征。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，56606v株對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞單層的穿透速度和穿透能力明顯優(yōu)于5

3、6606a株和PatocⅠ株；不同毒力的鉤體感染內(nèi)皮細(xì)胞單層，單層通透性均無明顯改變；56606v株和56606a株均未引起內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生明顯凋亡；鉤體穿透內(nèi)皮細(xì)胞單層主要是通過內(nèi)皮細(xì)胞胞體而非細(xì)胞間緊密連接。本部分研究說明有毒株鉤體對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞單層的穿透能力明顯強(qiáng)于減毒株和腐生型鉤體，其穿透能力可能與致病有關(guān)。不同毒力的鉤體均不引起內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性的增加，也不引起內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　 細(xì)菌嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)是指細(xì)菌在氨基酸饑餓，或碳源、溫

4、度、pH和鐵含量等變化時(shí)，細(xì)菌做出的應(yīng)急反應(yīng)，產(chǎn)生鳥苷四磷酸（ppGpp）或鳥苷五磷酸(pppGpp)，統(tǒng)稱為(p)ppGpp，關(guān)閉大部分代謝活性，提高菌株抗逆能力。嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)不僅是細(xì)菌適應(yīng)不良環(huán)境的一種應(yīng)激反應(yīng)，也與致病菌的黏附性、毒素表達(dá)、運(yùn)動(dòng)性及其他毒力因子的調(diào)控有著密切聯(lián)系。我們推測(cè)鉤體與嚴(yán)謹(jǐn)反應(yīng)相關(guān)的rel基因也與鉤體毒力因子的表達(dá)和調(diào)控密切相關(guān)。
　　 本研究的第二部分主要致力于對(duì)鉤端螺旋體Lai株rel基因的功能分析

5、。首先構(gòu)建了鉤體Lai株rel基因的重組互補(bǔ)質(zhì)粒，異源回補(bǔ)至relA和spoT基因缺陷的大腸埃希菌（CF1678）體內(nèi)，根據(jù)回補(bǔ)后的CF1678菌株能否在MOPS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，可以判斷Lai株rel基因是否能回補(bǔ)大腸埃希菌relA和spoT基因的功能。將Lai株Rel蛋白的不同結(jié)構(gòu)域的編碼基因，分段回補(bǔ)至CF1678菌株中，分析各個(gè)結(jié)構(gòu)域在Lai株的Rel蛋白中的作用。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Lai株rel基因回補(bǔ)到CF1678菌

6、株體內(nèi)，可以回復(fù)CF1678菌株在MOPS培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)。Rel蛋白的不同結(jié)構(gòu)域編碼基因分段回補(bǔ)，發(fā)現(xiàn)缺失了HD結(jié)構(gòu)域編碼基因的片段回補(bǔ)CF1678菌株，該菌株不能在MOPS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。而缺失TGS或ACT結(jié)構(gòu)域編碼基因的片段回補(bǔ)，該菌株仍能在MOPS固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。本部分研究通過異源互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鉤體Lai株rel基因具有和大腸埃希菌relA和spoT基因相似的功能。HD結(jié)構(gòu)域可能在Rel蛋白中發(fā)揮磷酸水解酶功能，而TGS和A