結(jié)直腸癌相關(guān)基因TGFBR13’UTR microRNAs位點(diǎn)分析及其功能研究.pdf

1、研究目的:結(jié)直腸癌(Colorectal Cancer，CRC)是嚴(yán)重危害人類生命和健康的消化道惡性腫瘤之一。在世界范圍內(nèi)，每年有近100萬的新發(fā)病例，在西方國家的死亡率居第3位。在我國，近年來結(jié)直腸癌發(fā)病率和死亡率明顯上升，且年輕化趨勢(shì)日趨加重。結(jié)直腸癌與其他腫瘤一樣，是一個(gè)多基因參與、多因素作用下基因表達(dá)異常性疾病。為了提高CRC目前臨床治療的敏感性和特異性，了解CRC的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找CRC診斷及治療的靶向標(biāo)志物，優(yōu)化CRC的治

2、療方案是一直以來研究的熱點(diǎn)。目前，腫瘤相關(guān)基因的單核苷酸多態(tài)性(Single Nucleotide Polymorph Sims，SNPs)和表觀遺傳學(xué)標(biāo)記物的微小RNA(microRNAs，miRNAs)的報(bào)道為研究CRC發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制提供了新的觀點(diǎn)，也成為腫瘤研究熱點(diǎn)。
　　在已發(fā)現(xiàn)的人類基因組內(nèi)的SNPs位點(diǎn)中有大量多態(tài)性位點(diǎn)都位于3'端非翻譯區(qū)（3'Untranslated Region，3'UTR），且其中大部分SN

3、Ps都與腫瘤的發(fā)生息息相關(guān)。已有研究證實(shí)，這些位于3'UTR的SNPs能通過調(diào)控miRNA與mRNA的結(jié)合和（或）改變mRNA的空間構(gòu)象等方式來影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性，從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄與翻譯，進(jìn)而影響細(xì)胞的多種生物學(xué)功能和行為，如細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡以及腫瘤的發(fā)生等。
　　miRNA是一類長(zhǎng)度約19～24 kb的非編碼RNA，具有強(qiáng)大的基因調(diào)節(jié)功能，其通過與其靶基因mRNA的3'UTR互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的靶基因的

4、轉(zhuǎn)錄與翻譯。目前，已有多項(xiàng)研究證實(shí)miRNA靶位點(diǎn)的SNPs與結(jié)直腸癌的易感性相關(guān)，但揭示3'UTR的SNPs與靶基因的調(diào)控關(guān)系，仍有許多問題尚待解決。本項(xiàng)研究的目的是篩選并探討結(jié)直腸癌相關(guān)基因TGFBR13'UTR單核苷酸多態(tài)性，以及SNPs與miRNA之間的調(diào)節(jié)機(jī)制，分析其與結(jié)直腸癌的相關(guān)性，為進(jìn)一步探討結(jié)直腸癌發(fā)病的分子機(jī)制及基因表達(dá)調(diào)控研究提供重要實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　研究方法:本實(shí)驗(yàn)室采用“病例-對(duì)照”方法，收集已經(jīng)病理診斷證

5、實(shí)的瀘州及周圍地區(qū)漢族人群結(jié)直腸癌病例371例患者為研究對(duì)象，同期、同地區(qū)健康體檢者246例作為對(duì)照，利用PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/),Hapmap(http://hapmap.ncbi.nlm.nih.gov/)網(wǎng)站及Snpper數(shù)據(jù)庫(http://snpper.chip.org/)以及SHEsis-online軟件(http://analysis.bio-x.cn/myAn

6、alysis.php)，篩選出結(jié)直腸癌相關(guān)基因TGFBR13'UTR內(nèi)的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs334348，rs334349與結(jié)直腸癌易感性相關(guān)[1]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)將(1)借助RegRNA，RNAhybrid，miRanda，targetScan等軟件對(duì)CRC相關(guān)基因TGFBR13'UTR內(nèi)SNP進(jìn)行miRNA靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)，篩選出與rs334348，rs334349特異性結(jié)合的候選miRNA。(2)培養(yǎng)結(jié)直腸癌細(xì)胞株:HT29，LOV

7、O，SW620，HCT116，LS174T，并利用基因測(cè)序及酶切分型試驗(yàn)方法檢測(cè)出具有目標(biāo)SNP的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，用于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。(3)驗(yàn)證候選miRNA對(duì)結(jié)直腸癌相關(guān)基因TGFBR1轉(zhuǎn)錄水平和蛋白水平的影響。首先，利用陽離子脂質(zhì)體法，將候選miRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至具有目標(biāo)SNP的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，再分別利用Real-time qPCR技術(shù)及Western-blot的方法檢測(cè)候選miRNA對(duì)TGFBR1基因轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平的影響。(4)

8、采用SPSS17.0對(duì)所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)所得腫瘤細(xì)胞Real-time qPCR結(jié)果比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)(Independent Samples Ttest)，方差不齊時(shí)采用近似t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:(1)本論文篩選出與結(jié)直腸癌相關(guān)基因TGFBR13'UTR單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)rs334348，rs334349特異性結(jié)合且可信程度較高的miRNA為miR-133b和miR-204-5p。(2

9、)從5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中檢測(cè)到具有目標(biāo)SNP的結(jié)直腸癌細(xì)胞株的是HT29。(3)將候選miRNA轉(zhuǎn)入HT29結(jié)直腸癌細(xì)胞株后，Real-time qPCR結(jié)果表明:與miR mimics/inhibitors control組相比，hsa-miR-133b mimics與hsa-miR-204-5p mimics都能顯著降低HT29細(xì)胞中TGFBR1 mRNA的表達(dá)水平;而hsa-miR-133b inhibitors與hsa-miR-

10、204-5pinhibitors轉(zhuǎn)染后的HT29細(xì)胞中mRNA的表達(dá)水平都有顯著升高。(4)Western-blot結(jié)果表明:與miR mimics/inhibitors control組相比，hsa-miR-133b mimics和hsa-miR-204-5p mimics轉(zhuǎn)染后的HT29細(xì)胞中TGFBR1蛋白的表達(dá)水平降低，而hsa-miR-133 b inhibitors和hsa-miR-204-5p inhibitors轉(zhuǎn)染后的