‘津田’蕪菁UV-A誘導的泛素化相關(guān)基因BrUBC1和BrRUB1的克隆及表達分析.pdf

1、本實驗室前期在研究‘津田’蕪菁(Brassica rapa Tsuda’)根皮花青素的合成中發(fā)現(xiàn),各種光質(zhì)中只有UV-A能特異誘導‘津田’蕪菁根皮花青素的合成,可能存在UV-A特異誘導花青素合成的光信號轉(zhuǎn)導途徑；在差異蛋白組學篩選鑒定特定的光信號轉(zhuǎn)導因子過程中還發(fā)現(xiàn),UV-A光照處理后兩種泛素化相關(guān)蛋白質(zhì)增量表達。那么這兩種蛋白是否參與了‘津田’蕪菁中UV-A特異誘導花青素合成的信號轉(zhuǎn)導呢?為此,本論文在前期研究的基礎(chǔ)上,針對這兩個UV

2、-A誘導下差異表達的泛素化相關(guān)蛋白UBC和RUB進行了基因克隆以及相關(guān)表達分析,研究其在‘津田’蕪菁不同組織和不同UV-A光照時間段后的表達特性,并構(gòu)建過量表達載體,對這兩個基因進行轉(zhuǎn)化擬南芥,研究這兩個泛素化相關(guān)基因的過量表達是否影響花青素的合成,以篩選鑒定UV-A特異誘導的花青素合成相關(guān)信號轉(zhuǎn)導因子,這為進一步研究‘津田’蕪菁花青素合成受UV-A光誘導的分子機理提供基礎(chǔ)。本研究的主要結(jié)果如下:
　　 (1)從‘津田’蕪菁中克

3、隆到了兩個UV-A誘導下增量表達的泛素化相關(guān)基因,分別命名為BrUBC1、BrRUB1。Southern雜交檢測顯示BrUBC1、BrRUB1在‘津田’蕪菁基因組中有個6個拷貝和5個拷貝。生物信息學方法分析表明,BrUBC1是泛素結(jié)合酶E2家族的成員,BrRUB1是泛素類似蛋白。此外,還繪制了這兩個基因的進化樹,確定其進化地位。
　　 (2)BrUBC1和BrRUB1的表達特性分析
　　 通過Real-time PCR的

4、方法定量分析表明:‘津田’蕪菁膨大直根表皮不見光處的白色表皮部分BrUBC1比植株地上接受光照的各個部分的表達都要低,表明BrUBC1的表達是依賴光的。單獨對白皮進行UV-A照射后發(fā)現(xiàn),1 h的UV-A照射使BrUBC1表達顯著增加。白皮中BrRUB1的表達也受UV-A光誘導,長于1 h的UV-A照射使其表達量增加,但BrRUB1的高表達局限于花中,在根皮以及葉子中的表達及低。BrUBC1和BrRUB1的表達確實受UV-A光誘導。

5、>　　 通過構(gòu)建基因的亞細胞定位載體并在洋蔥表皮細胞中進行瞬時表達,在激光共聚焦顯微鏡下觀察到融合蛋白GFP-BrUBC1和GFP-BrRUB1定位于細胞核中。
　　 (3)BrUBC1和BrRUB1基因轉(zhuǎn)化擬南芥的研究
　　 通過Gateway技術(shù)將BrUBC1和BrRUB1基因構(gòu)建到過量表達載體pH7WG2D上,通過農(nóng)桿菌介導的擬南芥花絮真空滲透法,用于擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化以研究基因的功能,利用潮霉素篩選種子法,獲得了多