二噁英暴露引起氯痤瘡發(fā)病機理的研究.pdf

1、目的二噁英(Dioxins)是有機氯化合物生產(chǎn)合成過程中產(chǎn)生的一類非目的性化學物質(zhì)的總稱,是環(huán)境中毒性極強的持續(xù)性多氯代芳香烴化合物。二噁英具有廣泛的毒性作用和生物學效應,包括對免疫、生殖、發(fā)育等毒害作用,并可能造成子代畸形,同時還可能具有促癌的性質(zhì)。其中,氯痤瘡(chloracne)是人類暴露于二噁英后出現(xiàn)的敏感的皮膚效應。本研究以患有氯痤瘡的男性工人作為研究對象,取其患處皮損組織活檢標本作為生物標本,采用熒光定量PCR技術分析皮損處

2、組織中AhR、CYP1A1、GSTA1、c-fos和TGF-α五個基因表達的誘導程度；采用免疫熒光分析方法,檢測磷酸化表皮生長因子受體(p-EGFR)和磷酸化絲裂原激活蛋白激酶(p-MAPK)蛋白表達；采用mRNA熒光原位雜交法與激光掃描共聚焦顯微鏡結合及免疫組織化學方法,測定角蛋白17(CK17)和角質(zhì)形成細胞轉(zhuǎn)谷氨酰酶(TGk)基因和蛋白兩個水平在表皮層表達分布情況；同時進行體外細胞培養(yǎng)實驗,以HaCaT細胞為體外模型,采用RT-P

3、CR技術分析TCDD對體外培養(yǎng)細胞內(nèi)AhR和TGF-α基因表達的影響。綜合以上研究,為二噁英誘發(fā)氯痤瘡發(fā)病機制的研究提供了理論依據(jù)。 方法本次實驗以天津市某化工廠生產(chǎn)五氯酚鈉車間患有氯痤瘡的男性作業(yè)工人為患病組,對照人群為天津市區(qū)無職業(yè)接觸史的正常人群。遵照“最小創(chuàng)傷”的原則,采取研究對象患病處直徑為0.5cm,深度為0.2cm的皮膚,對照人群于相應部位取同樣大小的皮膚,用熒光定量PCR技術檢測皮損處組織中AhR、CYP1A1、

4、GSTA1、c-fos和TGF-α五個基因表達的情況；免疫熒光方法檢測p-EGFR和p-MAPK蛋白表達的情況；采用mRNA熒光原位雜交法與激光掃描共聚焦顯微鏡結合及免疫組織化學方法,測定CK17和TGk基因和蛋白兩個水平在表皮層表達分布情況體外細胞培養(yǎng)實驗中,對人角質(zhì)形成細胞進行體外TCDD染毒,分為5個染毒組和1個對照組,染毒后6、12、24和48h進行MTT細胞活力檢測,并觀察細胞增殖程度；同時應用RT-PCR對24hTCDD染毒

5、組進行AhR和TGF-α基因表達的測定,并分析二者間的關系。 結果各項指標測定結果如下： 1、資料基本特征描述：本研究調(diào)查了氯痤瘡組12人,平均年齡(52.08±7.62)歲；對照組12人,平均年齡為(51.42±5.30)歲。兩組人群在年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI),吸煙和飲酒狀況的分布不存在差別,均衡性良好。 2、對AhR、CYPIA1、GSTA1、c-Fos、TGF-α基因的誘導：二噁英的長期暴露引起氯痤瘡患者皮損處

6、皮膚組織中AhR、CYPIA1、GSTA1和c-fos基因mRNA表達水平均不同程度的誘導,表現(xiàn)為誘導上調(diào),分別為對照組的2.3倍、5.2倍、4.3倍和4.5倍,差別有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。而TGF-α mRNA表達含量與對照組比較差別無統(tǒng)計學意義(P=0.15)。 3、吸煙對患病組和對照組皮膚組織中CYPIA1 mRNA表達水平的影響：在對照組12人中,吸煙者9人,不吸煙者3人,吸煙組皮膚組織中CYPIA1 mRNA表達

7、水平與不吸煙組相比雖有所增加,但經(jīng)統(tǒng)計學分析差別無統(tǒng)計學意義(P=0.721)?；疾〗M12個人中,11個人為吸煙者,僅有一人不吸煙。 4、p-EGFR和p-MAPK蛋白表達情況：氯痤瘡組中p-EGFR和p-MAPK均呈陽性表達,p-EGFR主要分布在細胞膜和細胞漿,尤以細胞膜附近最明顯；p-MAPK的陽性信號主要呈核漿型。對照組中均陰性。 5、CK17和TGk基因和蛋白兩個水平在表皮層表達分布情況:CK17 mRNA和C

8、K17蛋白在正常皮膚各層染色陰性,在氯痤瘡患者皮膚組織中均有表達,陽性表達主要在棘細胞層。TGk mRNA和TGk蛋白在對照組僅見顆粒層陽性,其它各層染色陰性；在氯痤瘡組人群中,TGk mRNA和TGk蛋白染色從皮損顆粒層向棘細胞層擴散延伸,染色強度明顯增強。 6、細胞增殖程度的改變：無論染毒與否,人角質(zhì)形成細胞隨培養(yǎng)時間的延長均呈現(xiàn)生長增殖的趨勢,但在不同的染毒時間組,細胞生長增殖隨濃度增加的變化趨勢并不相同。在染毒6、12和

9、24小時組,細胞隨TCDD濃度的增加而不斷增殖,且增殖程度與染毒濃度間存在一定的相關關系,相關系數(shù)分別為0.561(P<0.01)、0.687(P<0.01)和0.720(P<0.01)。在48小時組,隨染毒濃度的增加細胞增殖表現(xiàn)為抑制狀態(tài),在濃度為7×10-11～7×10-8M范圍內(nèi)細胞增殖程度分別下降為對照組的95.56％、90.82％、86.61％、81.14％,且增殖程度與濃度呈高度負相關,相關系數(shù)為-0.829。 7、

10、細胞內(nèi)AhR和TGF-α的誘導：結果顯示,隨著TCDD濃度的增高,細胞中AhR的相對表達量呈現(xiàn)下降的趨勢,相關系數(shù)為-0.548;各染毒組與對照組相比,7×10-10M和7×10-9M兩組與對照組之間的差別有統(tǒng)計學意義(P<0.01),且它們的表達相對量分別為對照組的55％和45％。TGF-α mRNA的相對表達量隨濃度的增加則呈現(xiàn)上升的趨勢,相關系數(shù)為0.695(P<0.01);在7×10-10M和7×10-9M兩個高濃度組,相對表達

11、量與對照組的差別具有統(tǒng)計學意義(P<0.05),且其相對表達量是對照組的2.6倍、3.8倍。同時對AhR與TGF-αmRNA相對表達水平進行相關分析,兩者呈負相關,相關系數(shù)為-0.561(P<0.05)。結論氯痤瘡患者皮損處AhR,CYP1A1,GSTA1,和c-fos基因的表達水平明顯上調(diào),表明AhR/ARNT途徑很可能在二噁英誘導的氯痤瘡發(fā)病機制中發(fā)揮著重要的作用,二噁英有可能通過AhR依賴的方式增加了皮損處組織中SRC活性,進而引

12、起c-fos基因的表達水平的上升,這種持續(xù)的激活狀態(tài)再從多方面干擾細胞正常的增殖和分化,從而導致氯痤瘡的持續(xù)存在。氯痤瘡患者皮膚組織中EGFR和MAPK呈異常活化狀態(tài),表明它們很可能參與了氯痤瘡表皮細胞過度增殖的調(diào)節(jié)。同時氯痤瘡患者表皮CK17和TGk的異常表達,表明二噁英干擾細胞正常的增殖和分化,從而導致氯痤瘡的發(fā)生發(fā)展。 體外細胞培養(yǎng)實驗結果表明,在一定的染毒時間內(nèi)(6小時至24小時),TCDD對體外HaCaT細胞的增殖有促