二噁英暴露引起氯痤瘡發(fā)病機(jī)理的研究.pdf

1、目的二噁英(Dioxins)是有機(jī)氯化合物生產(chǎn)合成過程中產(chǎn)生的一類非目的性化學(xué)物質(zhì)的總稱,是環(huán)境中毒性極強(qiáng)的持續(xù)性多氯代芳香烴化合物。二噁英具有廣泛的毒性作用和生物學(xué)效應(yīng),包括對(duì)免疫、生殖、發(fā)育等毒害作用,并可能造成子代畸形,同時(shí)還可能具有促癌的性質(zhì)。其中,氯痤瘡(chloracne)是人類暴露于二噁英后出現(xiàn)的敏感的皮膚效應(yīng)。本研究以患有氯痤瘡的男性工人作為研究對(duì)象,取其患處皮損組織活檢標(biāo)本作為生物標(biāo)本,采用熒光定量PCR技術(shù)分析皮損處

2、組織中AhR、CYP1A1、GSTA1、c-fos和TGF-α五個(gè)基因表達(dá)的誘導(dǎo)程度；采用免疫熒光分析方法,檢測(cè)磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體(p-EGFR)和磷酸化絲裂原激活蛋白激酶(p-MAPK)蛋白表達(dá)；采用mRNA熒光原位雜交法與激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合及免疫組織化學(xué)方法,測(cè)定角蛋白17(CK17)和角質(zhì)形成細(xì)胞轉(zhuǎn)谷氨酰酶(TGk)基因和蛋白兩個(gè)水平在表皮層表達(dá)分布情況；同時(shí)進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn),以HaCaT細(xì)胞為體外模型,采用RT-P

3、CR技術(shù)分析TCDD對(duì)體外培養(yǎng)細(xì)胞內(nèi)AhR和TGF-α基因表達(dá)的影響。綜合以上研究,為二噁英誘發(fā)氯痤瘡發(fā)病機(jī)制的研究提供了理論依據(jù)。 方法本次實(shí)驗(yàn)以天津市某化工廠生產(chǎn)五氯酚鈉車間患有氯痤瘡的男性作業(yè)工人為患病組,對(duì)照人群為天津市區(qū)無職業(yè)接觸史的正常人群。遵照“最小創(chuàng)傷”的原則,采取研究對(duì)象患病處直徑為0.5cm,深度為0.2cm的皮膚,對(duì)照人群于相應(yīng)部位取同樣大小的皮膚,用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)皮損處組織中AhR、CYP1A1、

4、GSTA1、c-fos和TGF-α五個(gè)基因表達(dá)的情況；免疫熒光方法檢測(cè)p-EGFR和p-MAPK蛋白表達(dá)的情況；采用mRNA熒光原位雜交法與激光掃描共聚焦顯微鏡結(jié)合及免疫組織化學(xué)方法,測(cè)定CK17和TGk基因和蛋白兩個(gè)水平在表皮層表達(dá)分布情況體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中,對(duì)人角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行體外TCDD染毒,分為5個(gè)染毒組和1個(gè)對(duì)照組,染毒后6、12、24和48h進(jìn)行MTT細(xì)胞活力檢測(cè),并觀察細(xì)胞增殖程度；同時(shí)應(yīng)用RT-PCR對(duì)24hTCDD染毒

5、組進(jìn)行AhR和TGF-α基因表達(dá)的測(cè)定,并分析二者間的關(guān)系。 結(jié)果各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如下： 1、資料基本特征描述：本研究調(diào)查了氯痤瘡組12人,平均年齡(52.08±7.62)歲；對(duì)照組12人,平均年齡為(51.42±5.30)歲。兩組人群在年齡、身體質(zhì)量指數(shù)(BMI),吸煙和飲酒狀況的分布不存在差別,均衡性良好。 2、對(duì)AhR、CYPIA1、GSTA1、c-Fos、TGF-α基因的誘導(dǎo)：二噁英的長(zhǎng)期暴露引起氯痤瘡患者皮損處

6、皮膚組織中AhR、CYPIA1、GSTA1和c-fos基因mRNA表達(dá)水平均不同程度的誘導(dǎo),表現(xiàn)為誘導(dǎo)上調(diào),分別為對(duì)照組的2.3倍、5.2倍、4.3倍和4.5倍,差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而TGF-α mRNA表達(dá)含量與對(duì)照組比較差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.15)。 3、吸煙對(duì)患病組和對(duì)照組皮膚組織中CYPIA1 mRNA表達(dá)水平的影響：在對(duì)照組12人中,吸煙者9人,不吸煙者3人,吸煙組皮膚組織中CYPIA1 mRNA表達(dá)

7、水平與不吸煙組相比雖有所增加,但經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.721)?；疾〗M12個(gè)人中,11個(gè)人為吸煙者,僅有一人不吸煙。 4、p-EGFR和p-MAPK蛋白表達(dá)情況：氯痤瘡組中p-EGFR和p-MAPK均呈陽性表達(dá),p-EGFR主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞漿,尤以細(xì)胞膜附近最明顯；p-MAPK的陽性信號(hào)主要呈核漿型。對(duì)照組中均陰性。 5、CK17和TGk基因和蛋白兩個(gè)水平在表皮層表達(dá)分布情況:CK17 mRNA和C

8、K17蛋白在正常皮膚各層染色陰性,在氯痤瘡患者皮膚組織中均有表達(dá),陽性表達(dá)主要在棘細(xì)胞層。TGk mRNA和TGk蛋白在對(duì)照組僅見顆粒層陽性,其它各層染色陰性；在氯痤瘡組人群中,TGk mRNA和TGk蛋白染色從皮損顆粒層向棘細(xì)胞層擴(kuò)散延伸,染色強(qiáng)度明顯增強(qiáng)。 6、細(xì)胞增殖程度的改變：無論染毒與否,人角質(zhì)形成細(xì)胞隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)均呈現(xiàn)生長(zhǎng)增殖的趨勢(shì),但在不同的染毒時(shí)間組,細(xì)胞生長(zhǎng)增殖隨濃度增加的變化趨勢(shì)并不相同。在染毒6、12和

9、24小時(shí)組,細(xì)胞隨TCDD濃度的增加而不斷增殖,且增殖程度與染毒濃度間存在一定的相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為0.561(P<0.01)、0.687(P<0.01)和0.720(P<0.01)。在48小時(shí)組,隨染毒濃度的增加細(xì)胞增殖表現(xiàn)為抑制狀態(tài),在濃度為7×10-11～7×10-8M范圍內(nèi)細(xì)胞增殖程度分別下降為對(duì)照組的95.56％、90.82％、86.61％、81.14％,且增殖程度與濃度呈高度負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.829。 7、

10、細(xì)胞內(nèi)AhR和TGF-α的誘導(dǎo)：結(jié)果顯示,隨著TCDD濃度的增高,細(xì)胞中AhR的相對(duì)表達(dá)量呈現(xiàn)下降的趨勢(shì),相關(guān)系數(shù)為-0.548;各染毒組與對(duì)照組相比,7×10-10M和7×10-9M兩組與對(duì)照組之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01),且它們的表達(dá)相對(duì)量分別為對(duì)照組的55％和45％。TGF-α mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨濃度的增加則呈現(xiàn)上升的趨勢(shì),相關(guān)系數(shù)為0.695(P<0.01);在7×10-10M和7×10-9M兩個(gè)高濃度組,相對(duì)表達(dá)

11、量與對(duì)照組的差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),且其相對(duì)表達(dá)量是對(duì)照組的2.6倍、3.8倍。同時(shí)對(duì)AhR與TGF-αmRNA相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)分析,兩者呈負(fù)相關(guān),相關(guān)系數(shù)為-0.561(P<0.05)。結(jié)論氯痤瘡患者皮損處AhR,CYP1A1,GSTA1,和c-fos基因的表達(dá)水平明顯上調(diào),表明AhR/ARNT途徑很可能在二噁英誘導(dǎo)的氯痤瘡發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用,二噁英有可能通過AhR依賴的方式增加了皮損處組織中SRC活性,進(jìn)而引

12、起c-fos基因的表達(dá)水平的上升,這種持續(xù)的激活狀態(tài)再?gòu)亩喾矫娓蓴_細(xì)胞正常的增殖和分化,從而導(dǎo)致氯痤瘡的持續(xù)存在。氯痤瘡患者皮膚組織中EGFR和MAPK呈異?；罨癄顟B(tài),表明它們很可能參與了氯痤瘡表皮細(xì)胞過度增殖的調(diào)節(jié)。同時(shí)氯痤瘡患者表皮CK17和TGk的異常表達(dá),表明二噁英干擾細(xì)胞正常的增殖和分化,從而導(dǎo)致氯痤瘡的發(fā)生發(fā)展。 體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在一定的染毒時(shí)間內(nèi)(6小時(shí)至24小時(shí)),TCDD對(duì)體外HaCaT細(xì)胞的增殖有促