HLA-DRB1共同表位在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中作用機(jī)制及與強(qiáng)直性脊柱炎關(guān)聯(lián)性的研究.pdf

1、背景和目的:
　　類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以慢性滑膜炎為主要表現(xiàn)的自身免疫性疾病，常導(dǎo)致關(guān)節(jié)破壞和殘疾。發(fā)病機(jī)制尚不十分明確，與遺傳、環(huán)境因素及自身免疫功能紊亂等有關(guān)。其中遺傳因素約起到了60％的作用，HLA-DRB1等位基因編碼的五氨基酸序列QKAA，QRRAA或RRRAA與該病關(guān)系密切，被稱(chēng)為共同表位(shared epitope，SE)。共同表位存在三個(gè)同源的氨基酸序列:1、QKR

2、AA主要由HLA-DRB1*0401等位基因編碼;2、QRRAA，主要由HLA-DRB1*0404、HLA-DRB1*0101和HLA-DRB1*0405等位基因編碼;3、RRRAA，由HLA-DRB1*1001等位基因編碼，其中QKRAA在白種人中最常見(jiàn)，RRRAA在所有人群中最為罕見(jiàn)。然而，這些研究多基于遺傳學(xué)研究，共同表位在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中起到何種作用，其機(jī)制如何，目前尚不明確。
　　除類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎外，多項(xiàng)研究表明HLA-DR

3、B1共同表位與其他疾病相關(guān)。人類(lèi)疾病中，風(fēng)濕性多肌痛、巨細(xì)胞動(dòng)脈炎、Ⅰ型糖尿病、銀屑病關(guān)節(jié)炎、狼瘡、自身免疫性肝炎以及早發(fā)性慢性淋巴性白血病相關(guān)。另外，HLA-DRB1共同表位與犬的自發(fā)性關(guān)節(jié)炎相關(guān)。在HLA-DRB1*0401轉(zhuǎn)基因小鼠中，共同表位與自發(fā)糖尿病的發(fā)病率、膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎及自身免疫性腦脊髓炎的疾病嚴(yán)重度相關(guān)。然而，同樣與HLA-DRB1有著相關(guān)性的強(qiáng)直性脊柱炎是否與共同表位相關(guān)，目前未見(jiàn)報(bào)道。
　　因此，本研究旨在探

4、討HLA-DRB1共同表位在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及HLA-DRB1共同表位與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)系。
　　第一部分 HLA-DRB1共同表位在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中對(duì)CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的作用
　　目的:
　　觀察類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞對(duì)共同表位的免疫反應(yīng)，探討共同表位在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用和機(jī)理。
　　方法:
　　1.采集類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周靜脈血18例，健康人外周靜脈血17例。

5、
　　2.使用QIAGEN DNA抽提試劑盒，從外周血中抽提DNA。
　　3.采用SSP-PCR法對(duì)DNA樣本進(jìn)行HLA-DRB1基因分型，先進(jìn)行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10進(jìn)行低分辨分型。再對(duì)HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進(jìn)行高分辨分型，根據(jù)PCR條帶確定基因型。
　　4.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離收集，采用密度梯度離心法（Ficoll分離）。

6、　　5.將PBMC分為五組，分別加入刺激物刺激6小時(shí)。第一組為陽(yáng)性對(duì)照組，加入佛波酯(PMA)和離子霉素(Ionomycin);第二組加入HLA-DRB1*0401肽段（KDLLEQKRAAVDTYC）;第三組加入HLA-DRB1*0405肽段（KDLLEQRRAAVDTYC）;第四組加入 HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC);第五組加入培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。
　　6.PBMC使用熒光染料標(biāo)記表面標(biāo)志CD

7、3+和CD4+，破膜，熒光染料標(biāo)記胞內(nèi)細(xì)胞因子IFN-γ、IL-17，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果以IFN-γ、IL-17陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞占比表示。
　　7.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，數(shù)據(jù)使用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)間的比較采用Kruskal-WallisTest，兩組數(shù)據(jù)間的比較采用Nemenyi Test。顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，即判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:
　　1.HLA-DRB1共同表位可刺激共同表

8、位陽(yáng)性的類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生更多的IFN-γ，導(dǎo)致類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生以及疾病嚴(yán)重程度的加重。
　　2.在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，HLA-DRB1共同表位不能刺激CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生IL-17。
　　第二部分 HLA-DRB1共同表位在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中對(duì)CD11c+CD8-樹(shù)突狀細(xì)胞的作用
　　目的:
　　觀察類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者CD11c+CD8-樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)對(duì)共同表位的免疫應(yīng)答，探

9、討共同表位在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用和機(jī)理。
　　方法:
　　1.收集類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周靜脈血12例。
　　2.使用QIAGEN DNA抽提試劑盒，從外周血中抽提DNA。
　　3.采用SSP-PCR法對(duì)DNA樣本進(jìn)行HLA-DRB1基因分型，先進(jìn)行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*4以及HLA-DRB1*10進(jìn)行低分辨分型。再對(duì)HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進(jìn)行高分辨分型，根據(jù)PCR條帶確定

10、基因型。
　　4.外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離收集，采用密度梯度離心法（Ficoll分離）。
　　5.采用貼壁法培養(yǎng)樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)，分別于第1、3、5天加入GM-CSF、IL-4，第6天收集DCs。
　　6.熒光染料標(biāo)記DCs表面標(biāo)志CD11c、CD83，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
　　7.將DCs分為五組，分別加入刺激物刺激6小時(shí)。第一組為陽(yáng)性對(duì)照組，加入TNF-α;第二組加入HLA-DRB1*0401肽段(

11、KDLLEQKRAAVDTYC);第三組加入HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC);第四組加入HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC);第五組加入培養(yǎng)基為空白對(duì)照組。
　　8.熒光染料標(biāo)記DCs，選擇CD11c+CD8-細(xì)胞，破膜，熒光染料標(biāo)記胞內(nèi)細(xì)胞因子IL-6，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。結(jié)果以IL-6陽(yáng)性反應(yīng)細(xì)胞占比表示。
　　9.數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS19

12、.0進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)之間的比較采用Kruskal-Wallis Test。顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，即判斷為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.基因分型結(jié)果顯示:共同表位陽(yáng)性6例，其中基因型為HLA-DRB1*0401的2例，HLA-DRB1*0405的4例;共同表位陰性6例。
　　2.培養(yǎng)至第6天的DCs表型鑒定CD11c的比例為89.74±2.80％，CD83+的比例為6.81±1.04％，結(jié)合鏡下形態(tài)，為未成熟D

13、Cs。
　　3.HLA-DRB1*0401肽段(KDLLEQKRAAVDTYC)刺激后，HLA-DRB1*0401者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0％; HLA-DRB1*0405者CD11 c+CD8-DCs產(chǎn)生IL-6的比例為1.66±0.32;共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.83±0.46％。
　　HLA-DRB1*0405肽段(KDLLEQRRAAVDTYC)刺激后，HLA

14、-DRB1*0401者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.04±0.04％; HLA-DRB1*0405者CD11c+CDS-IL-6+DCs比例為0.11±0.07％;共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.52±0.18％。
　　HLD-DRB1*0402肽段(KDILEDERAAVDTYC)刺激后，HLA-DRB1*0401純合者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.03±0.03

15、％;HLA-DRB1*0405純合者CD11c+CD8-IL-6+DCs的比例為0.11±0.11％;共同表位陰性者CD11c+CD8-IL-6+DCs比例為0.26±0.17％。
　　4.共同表位陽(yáng)性和陰性者類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者其CD11c+CD8-DCs經(jīng)三組肽段刺激后產(chǎn)生IL-6的比例均無(wú)顯著性差異（P=0.304＞0.05和P=0.354＞0.05）。
　　結(jié)論:
　　在類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中，HLA-DRB1共同表位不能

16、刺激CD11c+CD8-樹(shù)突狀細(xì)胞產(chǎn)生IL-6。
　　第三部分 HLA-DRB1共同表位與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)系
　　目的:
　　探討HLA-DRB1共同表位與強(qiáng)直性脊柱炎的關(guān)聯(lián)性。
　　方法:
　　1.采集182例強(qiáng)直性脊柱炎患者的DNA樣本。健康對(duì)照組數(shù)據(jù)采用第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院風(fēng)濕免疫科實(shí)驗(yàn)室對(duì)404名健康人的HLA-DRB1基因分型結(jié)果。
　　2.采用SSP-PCR法對(duì)DNA樣本進(jìn)行HLA-DRB

17、1基因分型，先進(jìn)行HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04以及HLA-DRB1*10進(jìn)行低分辨分型。再對(duì)HLA-DRB1*01、HLA-DRB1*04進(jìn)行高分辨分型，根據(jù)PCR條帶確定基因型。
　　3.應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Chi-square Test檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)P＜0.05，認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)果:
　　1.強(qiáng)直性脊柱炎患者中，共同表位陽(yáng)性者37例，比例為20.33％;健康人中，